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       【摘要】 
       目的研究用乙醇溶液提取护心颗粒中人参和三七皂苷成分的工艺条件。方法以提取物中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的含量为评价指标，选择乙醇浓度、醇与药材量之比、提取时间及提取次数等为影响因素，进行L9(34)正交实验，优化提取人参和三七皂苷成分的工艺条件。结果乙醇溶液提取人参和三七皂苷成分的最佳工艺条件为用10倍量于药材的70%的乙醇溶液提取3次,每次提取2 h。结论乙醇溶液提取人参和三七皂苷成分的工艺条件合理可行。
       【关键词】  人参皂苷; 三七皂苷; 乙醇浸膏; 护心颗粒; 正交实验法
       Study on the Extraction of Ginsenoside and Notoginsenoside from Radix et Rhizoma of Ginseng and Notoginseng in Huxin Granules with Alcohol Solution
       MU Qiyun，RUAN Xinmin*
       (The Second College of Clinical Medicine, Guangzhou University of TCM, Guangzhou, Guangdong 510120,China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the extraction condition of ginsenoside and notoginsenoside from Radix et Rhizoma of Ginseng and Notoginseng in Huxin granules with alcohol solution. MethodsThe orthogonal design was used for the extraction condition. With the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1 and Rb1 as the evaluation indexes, evaluated the effects of the percent concentration of the alcohol. the ratio of the alcohol to herbal medicine material, the process time and the repeat times of extraction were inestigated.Results The optimum conditions of extraction were as follows: the concentration of the alcohol 70%, the ratio of the alcohol to herbal medicine material 10:1, refluxing for 2 hrs, and repeat 3 times. ConclusionThe optimum condition of extraction is steady and feasible.
       Key words：Ginsenoside; Notoginsenoside; Alcohol Extractives; Huxin Fang granules ; Orthogonal Design Test
       护心方是我院心脏中心在邓铁涛 “五脏相关-心脾相关”理论指导下，以“调脾护心”为主要治则，用于冠心病血运重建(冠脉搭桥术或冠脉支架术)后的中医干预治疗的基础处方之一。经过多年临床应用，取得了良好的疗效[1～4]。
       护心颗粒是护心方经现代制剂技术精制而成。人参和三七含有的皂苷、黄酮、多糖、微量元素、维生素、有机酸等有效成分，是护心颗粒组方中起调脾护心,补益心气,化痰祛瘀的重要成分。提取人参和三七浸膏是制备护心颗粒的基础工艺之一。本研究采用正交实验法，以高效液相色谱法测量浸膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的含量为评价指标，优选提取护心颗粒中人参和三七的皂苷成分的最佳工艺条件。现报道如下。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器高效液相色谱仪: Waters600 型泵,717 型自动进样器, Waters 2998 二极管阵列检测器 (美国Waters 公司);Empower pro system 色谱数据工作站;USC-320D型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限　公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公);BS224S型电子天平[北京赛多利斯(Sartorius)仪器系统有限公司];R501型旋转蒸发仪(上海中科机械研究所)。
       1.2 材料 生晒参产地吉林，三七产地云南，广州康美药业股份有限公司供应，并经刘茂贵主任中药师鉴定，分别为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 和五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.)F.H. Chen.的干燥的根及根茎，符合《中国药典》[5]各药项下的规定。 乙腈(色谱纯，DIMA 科技公司);乙醇(医用级，广东省广宁县葡萄糖药业有限公司);对照品三七皂苷R1(批号0745-200007)，人参皂苷Rg1(批号110703-200424) 和人参皂苷Rb1(批号110704-200318)，均由中国药品生物制品检定所供应;其他试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 正交实验设计 根据预试验和文献报道[6～9]，选取乙醇浓度、溶剂与药材用量之比、提取时间、提取次数等4个影响因素，每个因素选3个水平，按表1设计L9(34)正交实验。
       2.2 乙醇浸膏的提取 按照表2安排的实验条件，精密称量按处方比例混合的人参和三七药材粉末45 g，加入计算量和规定浓度的乙醇溶液，回流提取规定的时间和次数后，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩近干，得稠膏。用70%乙醇溶液解稠膏，转移至250 ml容量瓶中并稀释至刻度。每个实验重复两次。精密量取上述浸膏的70%乙醇溶液10 ml，置蒸发皿中，于水浴上蒸发至干，残留物用甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，经0.45 μm滤膜过滤;精密量取10 μl，注入高效液相色谱仪，按
       “2.3.1”项下的条件，测量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的峰面积。计算3种皂苷的质量分数，3种皂苷的质量分数之和;以两次试验的3种皂苷的质量分数之和为综合评分指标，每个水平对应的综合评分值之和K1、K2、K3，极差值R，列于表2。方差分析结果见表3表3 方差分析方差来源离差平方和(SSi)自由度(ν)方差(MS)F值显著性
       2.3 三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和Rg1的含量测定
       2.3.1 色谱条件色谱柱为 kromasil C18 柱(4.6 mm×250 mm ,5 μm);以乙腈为流动相A，水为B，进行二元线性梯度洗脱：0～20 min，20%A∶80%B;20～30 min,(20%～35%)A∶(80%～65%)B;30～60 min，(35%～20%)A∶(65%～80%)B。检测波长203 nm;流速为1.0 ml·min-1;柱温为室温。
       2.3.2 对照品混合溶液的制备 精密称取对照品三七皂苷R1 2.0 mg、人参皂苷Rg1 5.0 mg和人参皂苷Rb1 4.7 mg，置5 ml量瓶中，用甲醇使溶解，稀释至刻度，摇匀，制备成对照品混合溶液。
       2.3.3 线性关系考察精密称取对照品混合溶液2，4，8，12，16，20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg) 为横坐标绘制标准曲线。三七皂苷R1 在0.80～8.00 μg，人参皂苷Rgl 在2.00～20.00 μg，人参皂苷Rb1 在1.88～19.80 μg之间呈良好的线性关系。其回归方程分别为：
       三七皂苷R1:Y =2.962 2×105 X-3.361 7 ×104 , r =0.999 8;
       人参皂苷Rg1：Y =2.9036×105 X-7.134 8×104 , r =0.999 9;
       人参皂苷Rb1: Y =2.887 5×105 X-5.464 7×104 , r =0.999 9;
       图1 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的校正曲线
       2.3.4 精密度实验精密吸取同一对照品混合溶液10 μl，重复进样检测6次,记录峰面积，计算得到三七皂苷R1峰面积的相对标准偏差RSD=1.42%，人参皂苷Rg1峰面积的RSD=1.09%，人参皂苷Rb1峰面积的RSD=1.16%，3种皂苷峰面积之和的RSD=0.91%。 结果表明测量实验精密度良好。
       2.3.5 稳定性实验精密吸取同一供试样品溶液10 μl ,分别于0 ，2 ，4 ，6，8和10 h时进样，测定峰面积。按“2.3.3”项下的回归方程计算3种皂苷及它们之和的质量分数的RSD(%)：三七皂苷R1质量分数的RSD=1.25%，人参皂苷Rg1质量分数的RSD=0.97%，人参皂苷Rb1质量分数的RSD=1.04%，3种皂苷质量分数之和的RSD=0.81%。结果表明，在测量时间10 h 内，样品溶液稳定。
       2.4 正交实验的结果 表2中极差R值表明，影响因素主次为D>A>C>B。表3的方差分析结果表明，影响因素主次为C>D>A>B。每次提取时间(P<0.005)和重复提取次数(P<0.05)对提取工艺有显著的影响。使用6～10倍于药材量的50%～70%的乙醇溶液为提取溶剂,对提取物中皂苷的含量影响不显著(P>0.05)。但是，对于人参和三七这样贵重药材，为了增加浸膏的产量和皂苷含量，减少水溶性杂质，增加醇溶性物质，使用10倍于药材量的70%的乙醇比较好。因此，实验得到的最佳工艺条件应为A3B3C3D3，即用10倍于药材量的70%乙醇水溶液，提取3次，每次提取2 h。
       2.5 提取工艺的验证 精密称量按处方比例混合的人参和三七药材粉末45 g，共3份，采用优选的最佳工艺条件，进行提取工艺的验证。为了考察用70%乙醇提取的效果，增加了第4次用10倍于药材量的水再提取1 h。提取液按“2.2”项下方法分别处理，并按照“2.3.1”项下的条件，测量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和Rb1的峰面积。按“2.3.3”项下的回归方程计算3种皂苷及它们之和的平均质量分数和相对标准偏差(RSD%)。表4结果表明，优化的A3B3C3D3工艺条件具有可行和较好的重现性。
       另外，精密称取人参药材粉末2 g，共3份，分装于滤纸筒内，置于索氏提取器内，加氯仿150 ml，回流提取3 h，取出纸筒，挥发除去氯仿，药渣连同纸筒一起放入100 ml锥形瓶中，加50 ml用水饱和的正丁醇，放置过夜，称重， 超声处理30 min，冷至室温，称重，用水饱和的正丁醇补充减失重量，滤过，精密量取续滤液25 ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸发除去正丁醇，残留物用甲醇溶解，转移到10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为人参药材供试溶液。再精密称取三七药材粉末0.8 g，共3份。同法处理，制备成三七药材供试溶液。分别精密量取人参、三七药材供试溶液10 μl, 注入高效液相色谱仪，按照“2.3.1”项下的条件，测量3种皂苷的峰面积。按“2.3.3”项下的回归方程计算3种皂苷及它们之和的平均质量分数。按照处方比例计算，人参和三七混合药材中三七皂苷R1的质量分数为0.45%，人参皂苷Rg1和Rb1分别为2.65%和1.94%，3种皂苷之和为5.04%(见表5)。超声提取法被认为是提取率最高的一种方法[10]。本试验用10倍于药材量的70%乙醇提取3次，每次2 h。提取物中3种皂苷的质量分数之和为5.17%(见表4)，略高于超声提取法的皂苷含量，可认为人参和三七的皂苷成分基本提取完全。
       表4 提取工艺的验证结果　表5 人参、三七药材中皂苷含量
       3 讨论
       本研究选用乙醇回流提取法，用正交实验优选提取工艺，以10倍于药材量的70%乙醇水溶液回流提取3次，每次2 h。标志性皂苷成分三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和Rb1的质量分数为药材的5.17%，为总皂苷的99.36%，人参和三七的皂苷成分基本提取完全。所选工艺条件已应用于工业放大生产试验，效果良好。
       在验证实验中增加了第4次用水提取1 h。用水作溶剂，有利于丙二酰基类皂苷的提取(人参皂苷Rb1，Rb1，Rb1，Re等)[11]。但是，水溶性杂质增多，提取液难以过滤，浓缩费时。要不要用水提取第4次，取决于制剂工艺的需要：如果提取规模小，或者需要控制水溶性杂质和出膏率，无需用水提取第4次;如果大规模生产，人参和三七用量大，可以用水提取第4次，提取液浓缩后，调成弱碱性，使丙二酰基类皂苷脱去酰基，变成相应的人参皂苷，再用乙醇溶出皂苷，沉淀除去杂质，以便充分利用人参和三七贵重药材。
       目前，已从人参中分离鉴定了46种单体人参皂苷[12]，三七含有总皂苷类成分，且大部分皂苷与人参皂苷类成分相同[13]。提取含人参和三七的中药复方药材，其评价指标常用标志性成分人参皂苷。当然，使用的人参皂苷和三七皂苷作为对照品的种类越多，分析结果的代表性会越强，分析成本也越高。本研究选用三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和Rb1 为对照品，采用高效液相色谱法测定提取物中3种皂苷的含量，以3种皂苷含量的和作为评价指标，筛选正交实验的最佳工艺条件，具有较好的代表性，便于在生产中使用。
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