文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨二仙汤治疗男性更年期综合征临床疗效的个体差异与细胞色素P450 3A4(CYP3A4)酶基因单核苷酸多态性的相关性。方法76例肾阴阳两虚证男性更年期综合征患者使用二仙汤治疗3个月，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系症状量化评分法，并参考《中药新药临床研究指导原则》，对肾阴阳两虚证量化评分，用聚合酶链反应(PCR)扩增CYP3A4rs2242480基因，分析二仙汤的临床疗效与CYP3A4rs2242480酶基因单核苷酸多态性的关系。结果治疗组与正常对照组之间基因型及等位基因分布无显著性差异，有效组49例受试者中有30例的CYP3A4rs2242480基因型为C/T (61.22%)，无效组27例受试者中有17例的CYP3A4rs2242480基因型为C/C(62.96%)。基因组间治疗前、治疗后的症状、体征评分无明显差异;基因组间肾阴阳两虚证主证、次症评分也无明显差异。结论二仙汤治疗男性更年期综合征个体含CYP3A4rs2242480基因型为C/T有效率较高，个体含CYP3A4rs2242480基因型为C/C无效率较高。
       【关键词】  二仙汤; 男性更年期综合征; 细胞色素P450 3A4
       男性更年期综合征是男性从中年步入老年时期出现相应临床症状和体征的一组证候群，近年来研究证明，男性从中年以后雄性激素水平逐渐下降，引起上述症状[1]，临床上用睾酮作为补充治疗，但长期使用睾酮对身体多个系统和器官产生影响[2]，因此，使用中药二仙汤治疗是一个较好的选择。
       二仙汤是已故名医张伯讷教授在20世纪50年代所创的组方，它是一剂被用来治疗更年期综合征的经验方。经过几十年的临床观察，目前它已被广泛应用于临床。但在临床上应用二仙汤治疗男性更年期综合征对一些肾虚病人有效，但对另一些肾虚病人效果较差或无效，这是我们经常遇到的问题。即使中药的所用药物时间和药物量相同，也会出现不同的治疗效果，出现不同的疗效多归因于中药的品种，药物的炮制，煎煮火候等原因，很少从病人个体差异方面进行研究，由于对中药药物代谢动力学、生物利用度等方面研究工作甚少，缺乏为药物的临床应用提供可靠的资料，对中药的应用仍按照医生的临床经验以及习惯用法。
       我们选用二仙汤在治疗肾虚证男性更年期综合征出现的治疗差异，结合研究病人个体差异与细胞色素P450 3A4酶基因单核苷酸多态性的相关性，初步探讨中药治疗中出现的不同的疗效个体对药物敏感性与药物代谢酶基因多态性的关系。
       1 资料与方法
       1.1 病例选择治疗组患者均来自本院男科门诊，共76例肾阴阳两虚证，年龄35～63岁，平均51岁;对照组为本院自愿者，共68例，年龄 32～50岁，平均42岁。
       1.2 入选标准
       1.2.1 西医诊断标准为了对患者症状诊断性筛查具有客观性，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系将症状量化的方法，对男性更年期综合征症状评分，体能症状 + 血管舒缩症状≥ 5 分，精神心理症状≥ 4 分，性功能症状≥ 8 分者可诊断为男性更年期综合征。
       1.2.2 男性更年期综合征肾阴阳两虚证中医诊断根据国家《中药新药临床研究指导原则》，参考“肾阳虚证及肾阴虚证的临床研究指导原则”明确中医诊断[3]。主症：腰膝酸痛，畏寒肢冷，性欲减退，舌质淡暗，苔白干，脉沉细无力。次症：精神不振，头目眩晕，耳鸣，梦多易醒，脱发，夜尿频多，大便时秘时泄。按症状轻重分级，分为 4 级。
       1.2.3 排除标准①有急、慢性肝肾功能损害者和心功能损害者; ②有睡眠呼吸暂停综合症者; ③有红细胞增多症者; ④前列腺癌、良性前列腺增生伴有排尿障碍者; ⑤有严重心血管疾病及脑卒中病史者。
       1.3 治疗方法使用二仙汤治疗：仙茅 15 g，仙灵脾 15 g，巴戟天 10 g，当归10 g，知母 10 g，黄柏 10 g。1剂/d，水煎至150～200 ml，分 2 次服，12周为1个疗程。
       1.4 安全指标观察每例对象治疗前后7:30～8:30前臂采血，做谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Creat)、游离睾酮(F-T)。
       1.5 疗效观察
       ①总分值=中医肾阴阳两虚证相关症状及体征分值+男性更年期综合征相关症状及体征分值
       ②疗效指数=(治疗前症状评分总分值-治疗后症状评分总分值) / 治疗前症状评分总分值
       1.6 疗效判定标准
       1.6.1 有效男性更年期综合征症状、体征好转; 疗效指数≥30%。
       1.6.2 无效男性更年期综合征症状、体征无改善;疗效指数<30%。
       1.7 实验研究
       1.7.1 试剂OIAamp DNA Blood MiniKits、内切酶RsaI，英韦创津生物有限公司。EDTABuffer50×1L Bio-Rad Laboratories，晶美生物工程有限公司。Taq Platinum PCR MasterMix 、DNALadders(50 bp)，天根生化工程有限公司。
       1.7.2 DNA提取取静脉血2 ml，经溶膜液/蛋白酶K消化，常规提取基因组DNA。
       1.7.3 PCR扩增①引物如下：1F：(5"-CAGAGCCAGCACGTTTTACA-3")1R：(5"―CGTGGCCCAATCAATTATCT―3")。②在各个反应管中分别加入Taq Platinum PCR MasterMix 25 μl，双蒸水21 μl;引物(10 pmol/L)各1 μl，DNA模板2 μl。③扩增反应在PCR热循环仪(美国Bio-Rad公司)上完成， 扩增参数为：95 ℃预变性3min;95℃ 30 s ，50℃ 30 s，72℃ 60 s ，共40个循环;72℃延伸7 min 。P C R产物片段长度为354 bp。
       1.7.4 扩增产物酶切扩增产物以限制性内切酶RsaI消化，酶切反应体系总体积 17 μl，包括PCR产物10 μl ，RsaI酶7 μl(1 u/μl)。酶切反应条件为37℃水浴过夜，在65℃下10 min终止酶切反应。
       1.7.5 基因型的判断RsaI酶切片段行2%琼脂糖电泳，判断基因型。一次性凝胶系统下拍照，根据条带判断其基因型：若出现了197，157 bp两个条带，则其为基因型T/T;若出现了354，197，157 bp三个条带，则其为基因型C/T;若仅出现了354 bp一条条带，则为基因型C/C。见图1～2。
       1.8 统计学方法采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，基因分值组间比较采用方差分析，方差不齐者采用秩和检验(Wruskal-Wal1isH)，计数资料组间构成比比较采用检χ2验，检验水平α=0.05。
       2 结果
       2.1 治疗前后总分值变化经二仙汤治疗后，76例男性更年期综合征患者治疗前后总分值见表1，其中疗效指数>30%占49例，二仙汤治疗男性更年期综合征的有效率为64.47%，疗效指数<30%的占27例，二仙汤治疗男性更年期综合征的无效率为35.52%。见图3。
       4.Marker;1，2，3，4，5，6，7，8，9为扩增产物，长度为354 bp
       图1 CYP3A4 rs2242480扩增产物图片
       2.2 基因型及等位基因分布所提取的DNA经过Ultrospec 4000UV/visible Spectrophotometer测定，其纯度均在1.7～1.9之间，可用于PCR扩增反应。χ2检验统计学分析，治疗组与对照组的基因型及等位基因分布差异无显著性(P>0.05)。见表2及 图4。两组间的人口学分布特征无差异。5，7.Marker;1，2.C/T基因型;3，4，6.C/C基因型
       图2 CYP3A4 rs2242480扩增后RsaI酶切图
       表1 二仙汤治疗前后总分值变化　图3 二仙汤治疗前后总分值变化
       表2 CYP3A4 rs2242480的基因型及等位基因分布　图4 CYP3A4 rs2242480基因型分布
       2.3 不同治疗效果CYP3A4 rs2242480基因型及等位基因分布治疗组依据疗效分为两组,有效组和无效组。有效组49例受试者中有30例的基因型为C/T(61.22%);而无效组27例受试者中有17例的基因型为C/C(62.96%)。见表3及图5表3 不同治疗效果CYP3A4 rs2242480的基因型及等位基因分布
       2.4 有效组CYP3A4 rs2242480基因型与阴阳两虚相关因素分析治疗有效者CYP3A4 rs2242480基因型与肾阴阳两虚证相关因素分析参考《中药新药临床研究指导原则》，不同基因型治疗有效者治疗前、治疗后的肾阴阳两虚证主证、次症评分无明显差异。见表4及图6。
       2.5 有效组CYP3A4 rs2242480组间症状评分及等位基因分布治疗有效者CYP3A4rs2242480组间症状评分根据伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系将症状量化的方法，二仙汤在治疗男性更年期综合征治疗前和治疗后，对体能、心血管、精神心理症状、性功能症状评分无明显差异。见表5及图7
       图5 不同疗效CYP3A4 rs2242480基因型分布
       2.6 治疗前后LH，FSH，F-T，ALT，Creat的变化治疗组服用二仙汤后黄体生成激素以及肌酐血浆浓度降低(P<0.05)，促卵泡激素、游离睾酮以及谷丙转氨酶无明显差异(P>0.05)。服用二仙汤后血浆黄体生成激素降低，而促卵泡激素无明显差异，对肝肾功能无损害。见表6及图8。表4 49例治疗有效组CYP3A4 rs2242480的基因型与肾阴阳两虚相关因素分析　　图6 49例治疗有效组CYP3A4 rs2242480的基因型与肾阴阳两虚相关因
       表5 49例治疗有效组CYP3A4 rs2242480组间症状评分及等位基因分布
       3 讨论
       存在于肝细胞微粒体中细胞色素P450 ( cytochrome P450，CYP ) 是一个基因超家族，与药物代谢有关，CYP450有许多亚族，其中最主要是CYP450 3 A亚族( CYP 3 A) ，占肝细胞CYP 4 5 0的3 0%～6 0% 。人类CYP3 A有4个亚型，但只有编码CYP 3 A4 、CYP 3 A5和CYP3A7的酶具有活性，这些酶可以参与结构不同的外源性物质的代谢[4]，现已发现CYP3A4参与了大约38个类别共150多种药物(约占全部药物50%)的代谢。
       图7 49例治疗有效组CYP3A4 rs2242480组间症状评分及等位基因分布 中药是一个复杂的巨系统，无论是复方还是单方，其药效都是其中多种化学成分相互作用所产生的综合效果。这些化学成分相互协同或相互拮抗，从而产生中药的药理作用[5]。二仙汤的主要组成中的仙灵脾有类似雄激素样的作用，仙灵脾水煎剂有可促进精液分泌，提高性功能;动物实验证实，小鼠腹腔注射仙灵脾提取物，可增加前列腺、精囊、提肛肌的重量，其效果与雄激素相当[6]; 仙灵脾能提高阴茎海绵体平滑肌cGMP浓度，对离体阴茎海绵体比较强的松弛作用[7]，仙灵脾主要成分为淫羊藿苷，属于黄酮类;黄酮类中药可以抑制或者诱导代谢酶P450，从而影响多种药物在体内、外的代谢[8]。CYP3A4参与大量内源性和外源性化合物的代谢，可被类固醇诱导，可代谢的内源性化合物包括孕酮、皮质醇、睾丸酮和雄稀二酮等激素和外源性化合物包括当归[9]、黄柏[10]等二仙汤组成成分。所以，我们选择CYP3A4基因为候选基因，研究二仙汤在治疗男性更年期综合征疗效的个体差异与细胞色素P4503A24(CYP3A4)酶基因单核苷酸多态性的相关性。
       表6 治疗前后LH，FSH，F-T，ALT，Creat的变化　　图8 治疗前后LH，FSH，F-T，ALT，Creat的变化
       二仙汤在治疗男性更年期综合征中，对体能状态，心血管状态，精神心理状态及性功能均明显改善，我们将二仙汤治疗肾阴阳两虚男性更年期综合征主症、次症评分比较，治疗前比治疗后有明显变化， 参照国家《中药新药临床研究指导原则》，比较二仙汤治疗男性更年期综合征疗效总分值，二仙汤治疗无效35.52%，有效64.47%，。
       经过临床观察统计，按照《中药新药临床研究指导原则》计算中药新药有效标准，计算出有效组49例，其中CYP3A4 rs2242480 C/T型有效30例，占总有效组61.22%;无效组27例，CYP3A4 rs2242480 C/C型占17例，达到62.96%。表明二仙汤治疗男性更年期综合征个体含CYP3A4 rs2242480基因型为C/T有效率较高，个体含CYP3A4 rs2242480基因型为C/C无效率较高。
       药物的生物转化是由多种药酶催化进行的，而药酶遗传多态性是引起临床药动学特征变异、药物不良反应和治疗失败的主要原因[11]。因此了解药酶的基因多态性是解决临床药物发挥正常药效和减少不良反应的基础，通过研究指导合理用药，来提高药物作用的有效性、安全性和经济性。通过研究药物代谢酶基因多态性与药物反应之间的内在联系，将对个体药物反应做出预测。在临床合理用药、个体化医疗及新药开发等方面带给人们的将是一次极大的机遇与挑战。基因多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性，可以阐明遗传因素对药物效用的影响，从而对个体化用药和药物开发提供指导和依据。
       【参考文献】
         　[1] 李宏军,李汉忠,郭应禄.应加强我国男性更年期综合征的研究[J].中华医学杂志，2005，85(13):870.
       
       [2] Cuzin B,Giuliano F,Jamin C,et al,Investigation ,treatment and surveillance of late-onset hepogenadism in males:the official guidelines of the International Society for the Study of the Aging Male (ISSAM) with comments.Prog Urol[J].2004，14(1)：1.
       
       [3] 中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002，5：164.
       
       [4] 毛晓琴，谢海棠，周宏灏.多药耐药蛋白和CYP3A4介导的中草药-西药相互作用[J].中国临床药理学与治疗学，2007，17(7)：728.
       
       [5] 刘昌孝.代谢物组学在中药现代研究中的意义[J].中草药，2004，35(6)：601.
       
       [6] Xin ZC, Kim EK, Lin CS,et al. Effects of icariin on cGMP-specific PDE5 and cAMP-specific PDE4 activities[J].Asian J Androl,2003，5(1):15.
       
       [7] 章振保，杨庆涛.淫羊藿甙抗大鼠雄激素部分缺乏的实验研究[J].中国男科学杂志,2006,20(3):46.
       
       [8] 杨秀芬，王乃平，曾繁典.中药有效成分对药物代谢酶的影响[J].中国中药杂志,2002,27(5)：325.
       
       [9] 吕良忠.中药对细胞色素P450影响的研究进展[J].浙江中医药大学学报,2006,30(3)：315.
       
       [10] 吴小红.78种生药提取物对人肝脏微粒体CYP3A4和CYP2D6的抑制作用[J].国外医学·中医中药分册，2005，27(6)：351.
       
       [11] Deckers CLP, Czuczwar SJ, Hekster YA, et al. Selection of antiepileptic drug polytherapy based on mechanisms of action: the evidence reviewed[J].Epilepsia, 2000，41:1364.