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       【摘要】 
       目的研究枸杞多糖诱导人食管癌细胞Eca-109凋亡作用及其作用机制。方法利用MTT染色在普通光镜下观察细胞凋亡形态学变化并观测枸杞多糖对肿瘤细胞的抑制率;通过流式细胞仪分析人食管癌细胞Eca-109凋亡率、细胞周期变化; DNA 琼脂糖凝胶电泳方法检测肿瘤细胞凋亡的DNA水平变化;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM) 检测细胞内钙离子浓度变化。结果经枸杞多糖作用后的人食管癌细胞Eca-109 出现核固缩、凋亡小体、新月状浓染区等细胞凋亡形态学改变,各剂量LBP 组的肿瘤细胞均表现生长抑制,且具有剂量依赖性, 1 000μg/ml LBP处理组的抑制率达96.02%。DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯形电泳条带。药物处理组的肿瘤细胞更多地被阻止于G2/M期,各剂量组均出现明显的凋亡变化,最大凋亡率可达21.3%。各剂量药物处理组的肿瘤细胞内的Ca2+浓度明显高于对照组( P<0.01)。结论枸杞多糖可明显抑制人食管癌细胞Eca-109的生长增殖,诱导细胞凋亡,并能改变该肿瘤细胞周期分布, 阻止细胞周期于G2/M期。
       【关键词】  枸杞多糖; 人食管癌细胞Eca-109; 细胞凋亡
       枸杞多糖(Lycium bararum polysaccharides,LBPs)是传统中药材枸杞的主要成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖组成。近年来,对枸杞多糖的药理作用进行了广泛的研究,发现枸杞多糖具有调节机体免疫、抗肿瘤等功能[1～3],枸杞多糖的研究已成为当前的热门课题。我们对枸杞多糖诱导人食管癌细胞Eca-109凋亡进行了系统研究, 现报道如下。
       1 材料与方法
       1.1 材料人食管癌细胞株Eca-109,由河北医科大学第四医院科研中心引入, 后经我校中心实验室传代。枸杞多糖由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取，纯度超过99%。
       1.2 细胞培养 将人食管癌细胞株Eca-109 置于RPMI1640 培养液中( 含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml),在37℃,饱和湿度, 5%CO2 培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后, 经0.25%胰蛋白酶消化,收集,调配成相应的细胞浓度。
       1.3 MTT试验制备成1×104/ml的Eca-109细胞悬液,吹打均匀后加入96孔板中,培养4 h 后,实验组分4个剂量组,分别加入不同浓度的枸杞多糖(1000，800，400，200μg/ml) ,对照组加入培养液,继续培养24h,然后每孔加入MTT ( 5 mg/ml)20μl,继续培养4 h。
       1.4 流式细胞仪分析 取实验组和对照组细胞样品,1 000 r/min 离心10 min,收集细胞,PBS洗涤2 次,配成1×106/ml细胞悬液,75%冷乙醇(- 20℃)固定24 h,上机测定前,离心去乙醇,用PBS 洗涤2次,加入不含Dnase 的RNA酶及EB染液,室温反应30min,上流式细胞仪测定细胞凋亡。
       1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 取800μg/ml LBP处理组细胞,以冷PBS 洗涤细胞,加裂解液600μl,混匀后加入10%SDS和蛋白酶K,55℃水浴3h,冷却后加等体积Tris- HCl饱和酚和氯仿-异戊醇(24∶1)提取细胞DNA。吸取上清液加等体积无水乙醇和1/10 体积NaAc沉淀DNA,用70%乙醇去残留的有机物,用去离子水溶解DNA,取DNA与溴酚蓝混匀,在1.5%琼脂糖凝胶中,80V电压下电泳30min。
       1.6 激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 检测细胞内钙离子浓度 取实验组和对照组细胞样品,分别1 000 r/min 离心10min,收集细胞,PBS 洗涤3次,离心,倒掉上清液, 加入50 μl Fluo- 3/AM(10 μmol/L),吹打均匀,在37℃恒温下负载60min,用D- Hank’s 洗3次,充分洗去未负载的荧光探针,用LSCM检测。
       2 结果
       2.1 细胞凋亡形态学变化 光镜下,可见处理各剂量组有不同程度的凋亡特征。表现为细胞贴壁不好,细胞形态不规整,细胞核固缩,有的出现核碎裂,偶见凋亡小体; 对照组细胞生长良好,细胞透明,形态饱满,颗粒较少,细胞核隐约可见,无细胞凋亡特征。
       2.2 MTT 染色检测枸杞多糖对Eca-109细胞的影响及抑制率 MTT 染色细胞在普通光镜下,实验组细胞形态不规则,体积缩小,形成的蓝紫色结晶聚集在细胞边缘,有的形成新月状或边界分明的颗粒块状浓染区,部分细胞成空泡状;对照组细胞结构完整, 胞浆连续,形成的蓝紫色结晶分布比较均匀。实验组与对照组比较肿瘤细胞存活率显著降低。结果见表1表1 枸杞多糖不同浓度对Eca-109 的抑制率
       2.3 流式细胞仪检测枸杞多糖对Eca-109 癌细胞凋亡的影响 不同剂量的枸杞多糖对Eca-109癌细胞有显著的促进细胞凋亡作用,呈剂量依赖关系。在DNA直方图的G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。枸杞多糖对Eca-109细胞周期产生明显影响,G2/M期细胞明显增多,G0/G1期细胞比率明显减少,多数细胞阻滞在G2/M期 。见表2表2 枸杞多糖对Eca-109 癌细胞凋亡率和细胞周期的影响
       2.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 琼脂糖凝胶电泳结果表明,经枸杞多糖处理的Eca-109细胞,DNA出现典型的梯形电泳条带(DNA ladder) 。
       2.5 LSCM检测结果 用药组细胞内Ca2+浓度明显高于对照组,有明显剂量依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3表3 枸杞多糖对Eca-109癌细胞内Ca2+浓度的影响
         　3 讨论
       细胞凋亡又称为细胞程序性死亡。通过细胞凋亡可保持机体组织的动态平衡， 是机体自我调控的重要机理。目前认为，许多肿瘤的发生就是由于该肿瘤细胞凋亡通道受阻而引起的。因此诱导肿瘤细胞凋亡成为抗肿瘤药共同的新靶点。甚至有学者认为细胞凋亡是不同作用机理抗癌药物殊途同归的结果[4，5]。
       本实验通过多个方面证明,枸杞多糖可诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡。从形态学上可见典型的凋亡特征,如细胞形态不规整,细胞核固缩,核碎裂,可见凋亡小体, MTT 染色可见新月状或边界分明的颗粒块状浓染区。枸杞多糖可显著抑制肿瘤细胞Eca-109的生长,其抑制率可达96.02%,有明显的剂量依赖关系。流式细胞仪检测结果显示,枸杞多糖处理的细胞,其DNA 直方图上可见G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。最大剂量组的凋亡率可达20.3%。肿瘤细胞都有其自身的生长周期规律,一般G0/G1 期时间最长,故G0/G1 期细胞比率最高,而G2/M期时间较短,处于G2/M期细胞比率最低，不同的抗肿瘤药可能对不同增殖周期具有选择性。流式细胞仪检测结果显示,枸杞多糖对人食管癌Eca-109细胞增殖周期有明显影响,药物使G2/M期细胞比率明显增加。这表明肿瘤细胞被阻止于G2/M期，更多的细胞损伤过重，超过了自身修复能力,难以通过G2 期限制点而发生凋亡[6]。细胞凋亡的另一重要生化特征是细胞核内限制性内切酶激活，将DNA 切成许多核酸片段，从而使DNA琼脂糖凝胶电泳分析时，呈现典型的DNA 梯形电泳条带。
       钙离子是细胞内的重要信息介导物质，通常称为第二信使。文献记载，当细胞内钙离子浓度过高，线粒体钙超载时，最终导致线粒体膨胀破坏，细胞能量耗竭，多种蛋白水解酶、磷脂酶激活，细胞色素C与凋亡诱导因子释放，细胞膜崩解，细胞死亡。故细胞内钙离子浓度与细胞凋亡有正相关性，了解细胞内钙离子浓度是确定细胞凋亡的重要依据[7，8]。LSCM检测结果显示,枸杞多糖处理组Eca-109细胞内Ca2+浓度明显高于对照组，药物浓度越大，Ca2+浓度增加越明显，这一结果进一步证实枸杞多糖有诱导Eca-109细胞凋亡作用。
       【参考文献】
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