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       【关键词】  土贝母皂苷；,,2．2．15细胞；,,乙型肝炎病毒；,,体外
       摘要：目的观察土贝母皂苷体外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果。方法以2．2．15细胞为靶细胞，给药后通过检测细胞表面及培养液中HBsAg，HBeAg和HBVDNA，观察土贝母皂苷抗HBV效果。结果土贝母皂苷各浓度组对HBsAg，HBeAg表达均有抑制作用，但以0.1 mg/ml作用48 h时最强，分别为43.46%和54.52%（P<0.01）；对HBVDNA的抑制作用以1 mg/ml组显著（P<0.05）。结论土贝母皂苷在体外有抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。
       关键词：土贝母皂苷；  2．2．15细胞；  乙型肝炎病毒；  体外
       Effect of Tubeimoside in AntiHBV Activity in vitro
       ZHOU Yanmeng, WU Zhongming, XIANG Xiaobo
       (Department of Microbiology in Zunyi Medical College, Zunyi, Gui zhou 563003, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of antiHBV activity in vitro．MethodsThe antiHBV activity of Tubeimoside was observed in 2．2．15cells(human hepatocellular carcinoma cells stably transfected with HBV)．ResultsTubeimoside could significantly reduce HBsAg、HBeAg level. After 48 hours of continuous exposure to Tubeimoside at the concentration of 0.1mg/ml in vitro culture, the inhibitions of HBsAg，HBeAg were 43.46％ ，54.52％ respectively(P<0.01). While the inhibitions of HBV DNA is significant at the concentration of 1mg/ml in vitro culture.ConclusionThe antiHBV effect of Tubeimoside is demonstrated in 2．2．15 cells．
       Key words：Tubeimoside；  2．2．15 cells；  HBV；  In vitro
   
　　乙型肝炎是由嗜肝DNA病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的一种世界范围内的传染性疾病。目前全世界约有3亿多人为慢性HBV 感染，我国约占半数。受HBV慢性感染的人群罹患肝硬化和原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的相对危险性至少增加100倍，并最终导致死亡，给人们的健康造成极大的威胁和损害。因此，寻求高效低毒的抗HBV的天然药物已成为刻不容缓的问题［1，2］。土贝母含有多种化学成分，具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种药理作用［3］。陈英俊等［4］曾用土贝母加入九三三肝泰丸中治疗乙型肝炎208例，总有效率为93.4%，说明土贝母在治疗乙肝的复方中起到了一定的作用，但土贝母是否具有抗HBV的作用国内外尚未见报道。为了观察土贝母皂苷对乙型肝炎病毒是否有影响，我们用HBV基因转染的人肝癌细胞系（HepG2）的2.2.15细胞体外培养作工具，检测土贝母皂苷在体外对乙型肝炎病毒的作用。现将实验结果报告如下。
       　　1  .材料与方法
       1.1  材料2.2.15细胞系HBV（adw亚型）基因转染的人肝肿瘤细胞株，购于武汉细胞保藏中心。土贝母皂苷为白色粉末（购自西安鸿生生物技术有限公司，批号：030816），4℃保存。拉米夫定（3TC），葛兰素威康（苏州）制药有限公司产品。MTT、RNAse、羊抗人IgGFITC和ELISA试剂盒购自北京华美生物工程公司。HBVDNA荧光定量PCR检测试剂盒购自深圳匹基生物工程公司。
       1.2   方法
       1.2.1  细胞培养及药物作用 细胞培养方法按文献［5］操作。待细胞长满培养瓶后，用0.25%胰酶消化成单个，配成1×105个细胞/ml，转接种于6孔、96孔培养板及25 ml培养瓶中。培养4 d后换含不同浓度（10，5，1，0.1，0.01 mg/ml）的土贝母皂苷培养液，分别作用24，48，72 h。每24 h换液1次，共培养72 h，换出的上清及收集的细胞置20℃保存备测。以相同条件不含药物培养液和阳性对照药物(拉米夫定)培养液培养的细胞作为对照。空白孔不加细胞，只加培养液。
       1.2.2  药物对细胞的毒性实验用MTT比色分析法［6］检测细胞吸光度值，与相应对照孔的吸光度值（存活细胞100）比较，按公式计算存活细胞的百分比，对细胞毒性进行动态观察。细胞存活率=（实验孔OD值/对照孔OD值）×100。
       1.2.3  药物对2.2.15细胞HBsAg，HBeAg和HBcAg的影响细胞爬片：用间接免疫荧光法［7］进行染色，于荧光显微镜下观察，以胞膜或核膜呈黄绿色荧光者为阳性。流式细胞仪（FACS  Calibur）检测：上机前细胞悬液用PBS液200 ml重悬，FITC受激发后发出黄绿色荧光，设定氩离子激发光源为488 nm，用Cell Quest软件采集细胞20000个再进行数据分析，以单参数直方图表示。
       1.2.4  药物作用后细胞培养上清中HBsAg，HBeAg和HBVDNA的检测HBsAg、HBeAg的检测：用酶联免疫吸附试验（ELISA法）分别检测每孔HBsAg，HBeAg的P/N值，操作按试剂盒说明书进行，根据公式计算抑制率：某药对HBsAg或HBeAg的抑制率=［（对照组平均P/N药物处理组平均P/N）/对照      组平均P/N］×100［8］上清中HBVDNA的检测：实时荧光定量PCR法操作按试剂盒说明书进行，结果以Ct值表示。
       1.3  统计学处理采用 SPSS10.0软件，配对t检验。
       　　2  结果
       2.1  药物的细胞毒性实验在加入不同浓度的土贝母皂苷和3TC作用24，48 h及72 h后，用显微镜观察细胞病变，72 h内土贝母皂苷1 ，0.1 mg/ml及0.01 mg/ml和3TC各组细胞形态与对照组无明显差别；土贝母皂苷10 mg/ml和5 mg/ml组作用至48 h细胞内空泡明显增大，细胞肿胀，72 h部分细胞破裂死亡。加入MTT液和DMSO溶解甲瓒颗粒后，测OD值并计算细胞存活率。结果见表1。土贝母皂苷各浓度组与对照组相比，在0.01 mg/ml浓度下实验组与对照组间差异无显著性，提示在该浓度下其对2.2.15细胞生长无毒性作用；在1 mg/ml及0.1 mg/ml浓度下，48 h内对细胞无毒性作用，当时间延长则对细胞产生毒性作用（P<0.05）。在同一时间内，随着土贝母皂苷浓度增加，细胞存活率下降，说明其对细胞的毒性也在增加。3TC在50 mg/ml浓度下72 h内未见明显细胞毒性。
       表1  土贝母皂苷、3TC在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性（略）
       与细胞对照组比较，*P<0.05,  cP<0.01；n=4
       2.2  免疫荧光法观察药物对2.2.15细胞HBsAg，HBeAg和HBcAg的影响
       2.2.1  细胞爬片免疫荧光染色法镜下荧光主要出现在胞膜和核膜上，为黄绿色荧光，无药对照组与用药组之间荧光强弱无明显差异。
       2.2.2  流式细胞仪检测细胞荧光强度测试结果（见表2及图1）显示：作用48 h后， 土贝母皂苷组HBsAg，HBeAg光道值与细胞对照组及阳性药物拉米夫定组比较明显减少（P<0.05或P<0.01）， HBcAg光道值无差异。
       表2  土贝母皂苷及3TC作用48 h后3种抗原荧光道值比较（略）
       与细胞对照组比较，*P<0.05,  **P<0.01;土贝母皂苷组与3TC组比较，△P<0.05,  △△P<0.01；n=3
       2.3  药物对2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg的影响
       2.3.1  对HBsAg的影响表3显示：土贝母皂苷各浓度组在3个时间点及3TC组在24 h和48 h时对2.2.15细胞分泌的HBsAg均有抑制作用。当药物作用至48 h时，各用药组对HBsAg的抑制率均达到最高，与细胞对照组比较有显著差异（P<0.01），土贝母皂苷0.1 μg/ml组抑制率达到43.46，较同一时间下3TC组抑制率高，但无统计学意义（P>0.05）。
       2.3.2  对HBeAg的影响土贝母皂苷各浓度组在3个时间点及3TC组在24 h和48 h时对2.2.15细胞分泌的HBeAg均有抑制作用。在48 h时土贝母皂苷各浓度组对HBeAg的抑制率与细胞对照组比较有显著差异（P<0.01），0.1 μg/ml和0.01 μg/ml组对HBeAg的抑制率明显高于3TC组，有统计学意义（P<0.05）；当药物作用至72 h时，土贝母皂苷各浓度组对HBeAg的抑制率虽有所降低，但与细胞对照组和3TC组比较仍有显著的差异（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。
       图1  土贝母皂苷及3TC作用48 h后FCM检测3种FITC标记　抗原荧光强度结果(流式细胞仪直方图分析结果)（略）
       表3  土贝母皂苷、3TC在2.2.15细胞培养中对HBsAg表达的抑制效果（略）
       各用药组与细胞对照组比较：*P<0.05,  **P<0.01;  土贝母皂苷各组与3TC50 μg/ml组比较：△P<0.05,  △△P<0.01； n=4
       表4  土贝母皂苷、3TC在2.2.15细胞培养中对HBeAg表达的抑制效果（略）
       各用药组与细胞对照组比较，*P<0.05,  **P<0.01;土贝母皂苷各组与3TC50 μg/ml组比较，cP<0.05,  ccP<0.01； n=4
       2.4  药物对2.2.15细胞中HBVDNA的影响在进行扩增过程中，土贝母皂苷1，0.1 mg/ml和0.01 mg/ml组及3TC组细胞上清中HBVDNA分别于Ct值27.71，26.84和26.33及27.50时被扩增出来，而细胞对照组在Ct值25.30时已被扩增出，说明各用药组细胞上清中HBVDNA的量较细胞对照组少，两种药物对上清中HBVDNA的复制均有抑制作用，同时统计学分析发现土贝母皂苷1 mg/ml及3TC组与细胞对照组比较有明显差异（P<0.05）。而土贝母皂苷各浓度组与3TC组比较均无统计学意义（P>0.05），二者对HBVDNA复制的抑制作用无差异。结果见表5。
       表5  土贝母皂苷、3TC作用48 h后对2.2.15细胞中DNA的抑制效果（略）
       各用药组与细胞对照组比较，*P<0.05；  土贝母皂苷各组与3TC50 μg/ml组比较，△P<0.05 ；n=7
       　　3  讨论
       对乙型肝炎的治疗至今尚没有一种药物能够达到满意的治疗效果，中医药是研究和开发新药的宝库，这类药物的不良反应相对较小。土贝母［9~11］（Tubeimu）是葫芦科假贝属植物Bolbostemma  paniculatum (Maxim) Franquet的干燥块茎，是一种传统中药，其化学成分包括皂苷类、甾醇类及其苷类、有机酸类等，而皂苷类为其中主要活性成分,它是一种新型的大环三萜式皂苷［11，12］。我们采用土贝母的活性成分土贝母皂苷，以2.2.15细胞为模型，研究土贝母皂苷对2.2.15细胞表面和分泌的HBsAg，HBeAg及细胞上清中DNA的作用。实验结果表明：一定浓度的土贝母皂苷：①对HBsAg和HBeAg均有抑制作用，且对HBeAg的抑制作用强于HBsAg；②对HBcAg均无抑制作用；③能抑制HBVDNA的复制，但作用弱于对HBsAg，HBeAg的抑制，提示药物对病毒颗粒产生抑制作用可能主要在mRNA翻译水平，而在HBVDNA水平的抑制作用次之。本实验研究虽然显示土贝母皂苷有较好的抑制HBsAg，HBeAg分泌及HBVDNA复制的作用，但由于体外实验研究结果不能反映体内所特有的免疫调节和体内代谢对药物效果的影响［13］，其抗病毒作用还须结合体内实验来确定，作用机制也还需要进一步的研究。
       　　参考文献：
       ［1］  陈  恒，刘书朋，陈  莉，等. 乙肝病毒核心蛋白及核心颗粒的结构及功能研究进展［J］.中国病毒学，2005，20（1）：95.
       ［2］  郑浩杰，刘国强. 利用2.2.15细胞株筛选抗乙肝病毒中草药的体外实验研究进展［J］. 陕西中医学院学报，2003，26（2）：61.
       ［3］  胥  戈. 土贝母化学成分及药理研究概况［J］.时珍国药研究，1992，3（4）：183.
       ［4］  陈英俊，史整社，马珍珠. 九三三肝泰丸治疗乙型肝炎208例临床观察［J］. 陕西中医， 1998，19（7）： 289.
       ［5］  陈压西，黄爱龙，郭  晖，等. 阿的福韦在鸭乙型肝炎模型及2.2.15细胞中抗乙型肝炎病毒的药效研究［J］.重庆医科大学学报，2004，29（5）：618.
       ［6］  司徒镇强，吴军正.细胞培养，第1版［M］.西安：世界图书出版公司，2004：199.
       ［7］  吴雄文，梁智辉. 实用免疫学技术［M］.武汉：湖北科学技术出版社，2002：61.
       ［8］  武永刚，倪  武，谬晓辉，等. 泛昔洛韦等三种药物抗乙型肝炎病毒的体外实验研究［J］.武警医学，2004，15（3）：191.
       ［9］  于立坚，马润娣，于廷羲，等. 土贝母苷甲和苷乙的抗肿瘤作用［J］.中国新药杂志，2002，11(9): 692.
       ［10］  Yang P, Yu TX, Ma RD, et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced  by tubeimoside in Hela cell［J］. Ai Zheng. 2002，21(4): 346.
       ［11］  胡  章，马润娣，于立坚. 土贝母苷甲对人HL60髓性白血病细胞周期和凋亡的影响［J］.中国肿瘤临床，2003,30(3): 163.
       ［12］  Yu TX, Ma RD, Yu LJ. Structure-activity relationship of tubeimosides in anti-inflammatory, antitumor, and antitumor-promoting effects［J］. Acta Pharmacol Sin. 2001，22(5): 463.
       ［13］  李常青，刘  妮，李小翠，等. 苦参碱脂质体抗乙型肝炎病毒的体外实验研究［J］.热带医学杂志，2003，3（1）:19.
       基金项目：贵州省卫生厅基金资助项目(No.D208)
       贵州省科技厅资助项目（No.C-273）
       贵州省遵义医学院基金项目（No. F-106）
       (遵义医学院微生物学教研室，贵州  遵义  563003)