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       【摘要】 
       目的建立测定蒿鳖养阴软坚方中大黄素含量的高效液相色谱(HPLC)方法。方法采用HPLC法，色谱柱Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.1%磷酸(75∶25);流速：1.0 ml·min-1;检测波长：254 nm。结果大黄素在2.64～26.4 μg·ml-1范围内呈良好线性关系，r=0.999 8，平均加样回收率为99.7%，RSD为2.7%(n=6)。结论该方法可将大黄素从复方中充分提取分离，专属性强，结果准确，可用于蒿鳖养阴软坚方的质量控制。
       【关键词】  蒿鳖养阴软坚方; 大黄素; 高效液相色谱法
       Determination of Emodin in Hao Bie Yang Yin Ruan Jian Fang by HPLC
       ZHANG Yuping1, XUE Chunlan2, FANG Buwu2*
       (1.Traditional Chinese Medicine of Tianjin University，Tianjin 300193，China; 2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China )
       Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of emodin in Hao Bie Yang Yin Ruan Jian Fang.MethodsThe emodin in Hao Bie Yang Yin Ruan Jian Fang was determined by HPLC. Hypersil ODS2 column(250 mm×4.6 mm) was used, 0.1% phosphoric acid:water (75∶25) was used as the mobile phase. The flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was set at 254 nm.ResultsThe linear range of emodin was 2.64～26.4 μg·ml-1, and the correlation coefficient was 0.9998, the average recovery rate was 99.7%, and RSD=2.7%(n=6). ConclusionThe established method is accurate, sensitive and simple. It can be used for quality control of Hao Bie Yang Yin Ruan Jian Fang.
       Key words: Hao Bie Yang Yin Ruan jian Fang; Emodin; HPLC
       蒿鳖养阴软坚方是由青蒿、鳖甲、虎杖、生地、丹参、白花蛇舌草等9味药组成，对5种肝纤维化动物模型有确切的抗肝纤维化作用，临床上对阴虚血瘀、血热毒蕴证型的肝纤维化有明显疗效。目前在中成药市场上还没有治疗和预防阴虚血瘀、血热毒蕴证型的肝纤维化的药物，因此研究该复方的质量标准对该新药的开发起到基础作用。本文以大黄素为指标成分，建立了蒿鳖养阴软坚方中大黄素含量的HPLC测定法，为该方的质量控制提供了客观的含量评价方法。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器6000 LDI 型高效液相色谱仪(美国COMETRO公司)，6000PVW UV/VIS 紫外检测器(美国COMETRO公司)，EZChrom Elite分析工作站，AX205十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
       1.2 试药大黄素对照品，购自中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110;蒿鳖养阴软坚方，由中新药业集团天津乐仁堂制药厂药研室制备，批号：070412，070522，070613;甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇∶0.1%磷酸(75∶25);流速1.0 ml·min-1;检测波长为254 nm，进样量为20 μl。
       2.2 对照品溶液的制备取大黄素对照品2.64 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中加甲醇适量，超声处理使完全溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液5 ml 置25 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
       2.3 供试品溶液的制备取本品粉末约0.2 g，精密称定，精密加入25 ml三氯甲烷和20 ml 稀硫酸溶液，称重，水浴回流2 h，冷却至室温，再称定重量，用三氯甲烷补足失重，分取三氯甲烷层，精密量取2.5 ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
       2.4 阴性对照样品溶液的制备根据处方组成，取除虎杖外的其余药味，按制剂工艺制备，制得缺虎杖的阴性样品粉末。按供试品溶液的制备方法同法处理制得阴性对照样品溶液
       2.5 系统适用性试验取大黄素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液各20 μl，在上述色谱条件下注入液相色谱仪，测绘色谱图，结果见图1。由图1可知，样品中大黄素的峰峰形对称，与相邻的色谱峰分离度大于1.5，分离效果良好，且阴性对照溶液对大黄素的测定无干扰。理论塔板数按大黄素计不低于3 000。1.大黄素关键峰a大黄素对照品 b复方供试品 c缺虎杖的阴性样品溶液图1 高效液相色谱图
       2.6 标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液适量至10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成浓度分别为2.640，3.168，4.224，5.280，6.336，10.560，26.4 μg·ml-1的系列对照品溶液，摇匀，分别吸取20 μl依次进样，按上述色谱条件测定大黄素峰面积值，以峰面积积分值(Y)对对照品浓度(X)进行线性回归，得回归方程：Y=4.420 4×104X-7.180 5×103，r=0.999 8。结果表明，大黄素对照品浓度在2.64～26.4 μg·ml-1的范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
       2.7 精密度实验精密吸取同一对照品溶液，连续进样5次，每次20 μl，测得大黄素峰面积的RSD为0.75%(n=5)，表明精密度良好。
       2.8 稳定性实验精密吸取同一对照品溶液，分别在 0，2，4，6，8，10 h 进样测定，结果大黄素峰面积的RSD为0.67%，供试品溶液在10 h内峰面积基本稳定。
       2.9 重复性实验取同一批号样品，按照“供试品溶液的制备”项下方法操作，制备6份供试品溶液，分别测定，结果大黄素峰面积的RSD为2.4%。证明此方法重现性良好。
       2.10 加样回收率实验精密称取已知含量的样品(批号070613)6份，每份约0.1 g，加入对照品溶液(214 μg·ml-1)1 ml，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别进行测定，计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率实验结果复方称样量m/g复方中大黄素含量m/mg大黄素加入量m/mg测得大黄素的含量m/mg回收率(%)
       2.11 样品测定取 3 批样品，按照“供试品溶液的制备”项下方法操作制备供试液，各进样 20 μl，计算大黄素的含量。结果见表2表2 样品含量测定结果批号进样量V/μl大黄素平均含量m/mgRSD(%)
       3 讨论
       虎杖为蒿鳖养阴软坚方的辅药，具有活血定痛、利胆退黄等作用，其主要成分大黄素具有保肝、抗微生物活性、抗炎等多种药理作用[1]，特别大黄素具有抗肝纤维化的作用并逐步阐明了其作用机制[2]，因此用大黄素作为本方的定量指标，同时也可部分体现本方的药理作用，具有重要意义，将有助于抗肝纤维化的新药蒿鳖养阴软坚方的进一步研究。
       本实验首先用甲醇超声提取，挥去溶剂后，加酸和三氯甲烷水浴加热回流提取[3,4]，并与直接加三氯甲烷和硫酸溶液，水浴加热回流提取的方法进行比较，结果表明，后者操作简便，重现性良好，且样品回收率高。
       本制剂为复方制剂，有效成分较多，参照2005版《中国药典》Ⅰ部以甲醇∶0.1%磷酸(80∶20)为流动相[5]检测，大黄素峰受到其他成分干扰，分离度较差，改用甲醇∶0.1%磷酸(75∶25)为流动相，分离度较好，且色谱系统重复性和精密度均好，适用于蒿鳖养阴软坚方中大黄素的定量分析。
       【参考文献】
         　　[1] 丁 艳，黄志华.大黄素药理作用研究进展[J].中药药理与临床,2007,23(5)：236.
       
       [2] 展玉涛，刘 宾，李定国，等.大黄素抗肝纤维化的作用机制[J].中华肝脏病杂志，2004，12(4)：245.
       
       [3] 孙文武.高效液相色谱法测定健肝颗粒中大黄素的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27(9)：1323.
       
       [4] 蒙 毅，范卫锋，钟一雄，等.HPLC法测定红穿破石中大黄素和大黄素甲醚[J].中草药，2007，38(9)：1410.
       
       [5] 国家药典委员会.中国药典， Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：17.