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       【摘要】 
       目的探讨利用氧耗剂建立乳鼠心肌缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法取SD乳鼠原代心肌细胞培养，观察氧耗剂连二亚硫酸钠不同浓度(1，2，3，4，5 ，6 mmol/L)分别缺糖缺氧1 h复氧 24 h及在4 mmol/L浓度下缺糖缺氧不同时间(5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h)后复氧24 h对心肌细胞存活率及培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的影响，并进行细胞形态学观察。结果乳鼠心肌细胞经过缺氧/复氧处理后，与正常对照组相比，连二亚硫酸钠可呈浓度依赖性降低心肌细胞存活率，尤其 Na2S2O4 浓度大于3 mmol/L时细胞MTT的OD值与正常对照组有显著性差异，同时上清液中LDH含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。而当连二亚硫酸钠4 mmol/L浓度下随着缺氧时间延长，细胞的存活率显著降低，而心肌细胞上清液中LDH的释放量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，呈现时间依赖性。结论应用连二亚硫酸钠可建立心肌细胞缺氧再灌注损伤模型。
       【关键词】  心肌细胞; 缺氧; 复氧; 细胞模型; 连二亚硫酸钠
       Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model in Neonatal Rat Cardiomyocytes by Oxygen Agent
       YU Wei, XU Bo, PENG Yan, WU Jiliang, LI Lu
       (Pharmacological College of Xianning University, Xianning,437100,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish hypoxia/ reoxygenation model in neonatal rat cardiomyocytes by oxygen agent.MethodsCultivate neonatal rat cardiomyocytes, observe the apoptotic cardiac myocyte by using MTT assay and after being given Na2S2O4 with different concentration (1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 mmol )for 1h and then reoxygenation for 24h;besides give Na2S2O4 with 4 mmol/L at different time(5, 15,30 min,1,2 ,4 ,6 h )and then reoxygenatie for 24 h.Biochemical method was used to determine lactate dehydrogenase (LDH) activity. ResultsNa2S2O4 could increase cell apoptosis and the level of lacate dehydrogenase (LDH) the supernatant fluid.ConclusionIt is an effective hypoxia/ reoxygenation mode of using Na2S2O4 in neonatal rat cardiomyocytes.
       Key words： Myocardial cells; Hypoxia; Reoxygenation ; Cell mode; Na2S2O4
       心肌缺血/再灌注损伤是临床常见的病理过程，探讨其发病机制并寻找有效的防治措施是目前医学研究领域的一项重要内容。制备离体乳鼠心肌局部缺血/再灌注模型是进行相关研究的常用方法。因此，制备简便易行、稳定可靠的缺血/再灌注模型具有重要的实用价值[1]。鉴于以上原因，本文通过氧耗剂连二亚硫酸钠致心肌缺氧的最佳浓度和时间寻求制备一种稳定简便的心肌缺氧再复氧模型。
       1 材料与仪器
       1.1 动物Sprague Dawley 0～2日龄乳鼠15只(华中科技大学同济医科医学院实验动物中心提供，准字号：SCXK 2004-007)。
       1.2 药品与试剂连二亚硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴盐即噻唑蓝3-(4,5-dime-thylthiaml-2y1)-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT) ( sigma公司;胰酶(1∶250 Amresco公司);胎牛血清 (浙江杭州四季青公司);DMEM培养基(GIBCO);5-溴脱氧尿嘧啶(SIGMA);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
       1.3 主要器材ALE-200型电子分析天平(湘仪天平仪器厂);YXJ-1型离心机(SIGMA); CO2 培养箱(HERAEUS);酶标仪(MAGELLAN);CKX41型倒置显微镜(OLYMPUS)。
       2 方法
       2.1 心肌细胞培养[2,3]将含 10 % 胎牛血清的DMEM培养基无菌分装，预先置于 37℃，5 % CO2 培养箱中温育饱和。取新生 Sprague-Dawley 乳鼠 15只，消毒后放入无菌操作台上，无菌条件下开胸取心，立即用冰 D-hanks" 液洗去残血，剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小的碎片，加入适量的 0.1 % 胰蛋白酶，置37 ℃水浴中振荡10 min消化，去上清，沉淀继续用0.1% 胰酶37 ℃ 水浴，分次消化并经 200 目一次性筛网过滤成单细胞悬液后，加入血清培养基终止消化后 1 500 r/min离心 5 min，收集沉淀，加入含5-溴脱氧尿嘧啶的正常培养液于37 ℃，5 % CO2饱和湿度条件下差速贴壁 2 h 后，调整细胞浓度至(1~5)×106 / L，每孔300 μl 接种到96 孔培养板上，置入37 ℃，5 % CO2 饱和湿度培养箱中继续培养，于接种48 h后换正常培养基继续培养。
       2.2 连二亚硫酸钠缺氧复氧模型制备
       2.2.1 不同浓度连二亚硫酸钠对心肌细胞的影响 取培养4 d的心肌细胞，随机分为8组，每组12孔：①正常对照组，用高糖DMEM孵育;② 单无糖 Earle"S液组;③连二亚硫酸钠1， 2，3，4 ，5，6 mmol/L+无糖 Earle"S液组;置37 ℃，5 % CO2中培养，于1 h后换高糖DMEM继续培养24 h。重复两次。
       2.2.2 不同作用时间对心肌细胞的影响将培养4 d 的心肌细胞随机分为8组，每组12孔：①对照组，用高糖DMEM孵育;②连二亚硫酸钠4 mmol/L +无糖 Earle"S液分别缺氧5 min，15 min，30 min， 1，2，4，6 h后换高糖DMEM液继续培养24 h。重复两次。
       2.3 相关指标测定
       2.3.1 MTT 法细胞存活率测定吸弃 96 孔板各孔液体，加入 DMEM 培养基 270 μl，再加入5 g/L MTT 工作液 30 μl 混匀，37 ℃孵育 4 h ，弃去孔内培养液，每孔加入 270 μl DMSO，振荡 10 min 使充分溶解。酶标仪 490 nm 波长测量各孔OD值。以正常组OD值为对照，计算各孔细胞存活率(﹪)= 各组OD值均值/正常组OD值均数 × 100%。
       2.3.2 培养上清液中LDH水平采用试剂盒说明书操作，于酶标仪450 nm处测定其吸光度值。
       2.4 统计学方法采用SPSS11.0 版统计软件，实验数据用± s表示，组间比较采用t检验。
       3 结果
       3.1 氧耗剂对心肌细胞形态的影响倒置显微镜下可见正常培养72 h的细胞单层规律性的同步搏动，搏动有力，搏动频率80 ~ 100 min-1。给予氧耗剂Na2S2O4后可见细胞搏动频率减慢，部分皱缩、漂浮、死亡，且当Na2S2O4浓度越高，作用时间越长时，坏死细胞越多。
       3.2 不同浓度连二亚硫酸钠作用后心肌细胞存活率及LDH水平实验结果表明，Na2S2O4 可致心肌细胞存活率下降，尤其当Na2S2O4 浓度超过3 mmol/L时MTT测定细胞OD值与正常对照组有显著差异(P﹤0.01)。同时心肌细胞上清液中LDH释放量均高于正常组，呈浓度依耐性。表1 不同浓度 Na2S2O4 作用后心肌细胞存活率及LDH水平
       3.3 Na2S2O4 不同作用时间心肌细胞存活率及 LDH 变化同一浓度下，Na2S2O4 与细胞作用时间越长，Na2S2O4 对细胞的损伤越显著，细胞存活率越低。Na2S2O4可使细胞MTT的OD值与正常对照组有显著差异。缺氧/复氧后心肌细胞上清液中LDH释放量均高于正常组，且呈时间依耐性。表2 Na2S2O4 不同作用时间心肌细胞存活率及LDH水平
       4 讨论
       在细胞水平上，常以乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模拟载体心肌缺血/再灌注损伤。心肌细胞缺氧/复氧后引起损伤的机制与氧自由基的释放、钙超载、细胞死亡和凋亡等有关[4]。Na2S2O4 作为一种氧清除剂，不仅不会损伤细胞膜[5]，且一般在给予适当剂量 2～10 min 即可清除培养基中的氧，造成心肌细胞缺氧[6];缺氧后换液，洗去 Na2S2O4 后即造成复氧[7]。然而国内对应用化学制剂制作心肌细胞缺氧模型的研究鲜有报道，为了更好地建立氧耗剂致心肌缺氧的模型，我们采用原代培养的心肌细胞建立了 Na2S2O4 缺氧复氧模型，旨在为心肌缺血再灌注机制的研究和药物筛选奠定基础。MTT 比色分析法是根据活细胞能选择性地将四甲基偶氮唑盐还原成蓝黑色的甲膳沉淀物的原理而建立的测定活细胞的方法，其操作简单，客观准确，能反映细胞与药物的关系，便于实验室开展。LDH 是反映心肌损害的主要生化指标，其可信度高，重复性好。心肌细胞损伤后LDH将释放在细胞外液[8]，细胞外液中LDH活性的高低一定程度上反映了Na2S2O4 对心肌细胞的损伤程度。结果显示，Na2S2O4可使心肌细胞存活率急剧下降，缺氧各实验组培养基中的 LDH 含量明显高于正常对照组，并随着氧耗剂浓度的增高和缺氧时间的延长而较正常对照组明显增高。综上所述，我们认为 Na2S2O4 构建的缺氧模型起效快、操作简单、便于控制且使用安全，是一种值得推广的方法。
       【参考文献】
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