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       【摘要】 
       目的观察芒果苷磺酸钠体内外抗白血病的作用。方法采用MTT法,观察不同浓度芒果苷磺酸钠对K562细胞生长的影响;建立小鼠K562白血病模型，考察芒果苷磺酸钠对K562白血病小鼠的生命延长率。结果不同浓度的芒果苷磺酸钠在不同时间对K562细胞均有抑制作用, 并随浓度升高和作用时间延长而抑制作用增强,但其抑制作用稍弱于同浓度的芒果苷;芒果苷磺酸钠能明显提高K562白血病小鼠的生命延长率。 结论芒果苷磺酸钠有较好的体内外抗白血病作用。
       【关键词】  芒果苷磺酸钠; K562细胞; 白血病
       Experimental Study on Antileukemia Effect of Mangiferin Sulfonate Sodium
       YUAN Yefei1，2,DENG Jiagang2,HU Xiangyu1,OU Xianhong3
       (1.Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000，China;2.Guangxi Traditional Chinese Medical University，Guangxi Nanning 530001，China;3.Guilin Medical College, Guangxi Guilin 541004，China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the antileukemia effect of mangiferin sulfonate sodium in vitro and vivo.MethodsThe effect of different concentrations of mangiferin sulfonate sodium on the proliferation of K562 leukemia cells was examined by MTT assay;and the mouse survival rate was observed by establishing K562 antileukemia model in mice.ResultsDifferent concentrations of mangiferin sulfonate sodium inhibited the K562 cell proliferation in different time, the inhibition effect was dependent on time and concentration,but its inhibition effect was slightly weaker than the same concentration mangiferin. Mangiferin sulfonate sodium could obviously prolong mouse survival time.ConclusionMangiferin sulfonate sodium has good antilelkemia effect in vitro and vivo.
       Key words： Mangiferin sulfonate sodium; K562 cell; Leukemia
       芒果苷,又名芒果素、知母宁,广泛存在于百合科植物知母,漆树科芒果树、扁桃树的叶、果实和树皮,龙胆科植物东北龙胆、川西獐芽菜,水龙骨科植物光石韦等植物中。芒果苷为芒果叶的主要成分,含量达1.92%[1];芒果苷也为川西獐牙菜的主要成分，它在川西獐牙菜中的含量达0.98%[2]。芒果苷具有多方面的生理活性和药理作用，有止咳、祛痰、平喘及抗炎、免疫、保肝利胆、抗脂质过氧化、抗病毒、抗菌、抗糖尿病和抗肿瘤等作用[3]。
       芒果苷还具有抗白血病作用，芒果苷可抑制慢性髓系白血病K562细胞的增殖，并可能通过抑制bcr/abl融合基因的表达诱导K562细胞凋亡[4]。
       但芒果苷是一种四羟基的酮碳糖苷(图1),水溶性极差,难以制成合适浓度的稳定药液,影响其疗效及其应用。增加难溶性药物的溶解度以满足治疗需要,是中药制剂的重要问题。前期我们通过结构修饰在芒果苷的4-位引入了-SO3Na(磺酸钠基),制备得到芒果苷磺酸钠盐(如图2),改善了芒果苷的水溶性。本实验通过噻唑兰(MTT)方法研究其对白血病K562细胞株的增殖抑制作用,并通过体内试验验证其抗白血病的作用，为其开发为抗白血病新药提供理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 药物 Eagles MEM干粉和G148，美国Gibco公司产品;MTT及DMSO，美国Sigama公司产品;L-谷氨酰胺，北科化学试剂公司进口分装;胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品;卡那霉素，Sigma分装;MEM 培养液含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺，G418 380 g/ml，卡那霉素50 U/ml，pH 7.2。细胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Hangs配制;环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，临用时以生理盐水配成2 mg/ml的溶液;芒果苷磺酸钠(自制，纯度95%)，以生理盐水配制成10，5.0，2.5 mg/ml 3种浓度的溶液。
       图1 芒果苷的结构 图2 芒果苷磺酸钠的结构
       1.2 细胞株 人慢粒白血病细胞株K562购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库, 并由泸州医学院毒理研究所细胞室传代保存。
       1.3 仪器 CO2培养箱(Thermo Forma)，美国产，型号381;倒置显微镜(Olympus)，日本产，型号CK40;酶标仪(Biocel1)，奥地利产，型号Sunrise。
       1.4 动物健康昆明种小鼠,雌雄各半，体质量(20±2) g，由泸州医学院实验动物科提供，合格证号：川实动证第07216号。
       2 方法
       2.1 细胞生长抑制试验取对数生长期的K562细胞, 调整细胞浓度为5×104/ml, 接种于96孔培养板, 每孔加20 μl细胞液。药物(芒果苷磺酸钠和芒果苷)用培养液配成1 mg/ml,实验组均分别以不同终浓度(31.3，62.5，125，250，500 μg/ml) 芒果苷磺酸钠和芒果苷处理, 另设对照组(不加药)和空白组(只加培养液), 每组设4个复孔, 培养24，48，72和96 h后, 加入MTT 10 μl, 4 h后, 离心弃上清液, 每孔加入DMSO150 μl，轻轻振荡, 待结晶完全溶解, 10 min后,在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值, 计算平均抑制率,并以改良寇式法计算半数抑制浓度IC50[5]，实验重复3次(n=12)。按如下公式计算抑制率和IC50：抑制率(%)=(对照组平均OD值- 实验组平均OD值)/对照组平均OD值;IC50=lg-1[Xm-i (∑p-0.5)]，式中Xm：设计的最大浓度的对数值;i：相邻两组浓度对数值之差;∑p：各组生长抑制率之和;0.5：经验常数。
       2.2 芒果苷磺酸钠对荷瘤小鼠生存期的影响无菌条件下抽取接种7 d、生长良好的K562白血病小鼠腹水，用灭菌生理盐水(1∶3)稀释，按0.2 ml/只经腹腔注射(约5～6×106个瘤细胞)腹水(活细胞率>95%)，制备腹水型荷瘤小鼠模型。接种后24 h随机分成5组,每组15只，ip给药,0.4 ml/只，共计10 d。①模型组，生理盐水;②芒果苷磺酸钠3个剂量组分别为200，100，50 mg/kg;③阳性对照组，环磷酰胺20 mg/kg。连续30 d记录各鼠死亡时间，计算各组小鼠平均生存天数、生命延长率。生命延长率(%)=(治疗组平均生存天数一模型组平均生存天数)/模型组平均生存天数×100%。
       2.3 统计学方法检验各组测定结果以 ±s表示，组间均数比较用t检验。
       3 结果
       3.1 芒果苷磺酸钠对K562细胞增殖的影响MTT试验分析表明芒果苷磺酸钠和芒果苷对K562细胞均具有直接的细胞生长抑制作用, 并且作用均随药物浓度升高及作用时间延长而增强,呈现良好的量效和时效，作用96 h时，500 μg/ml的芒果苷磺酸钠和芒果苷对白血病K562细胞的 平均抑制率分别达到75.6%和73.6%。芒果苷磺酸钠与芒果苷相比，对K562细胞的生长抑制作用稍弱，其半数有效浓度IC50分别为151.6 μg/ml和143.2 μg/ml，但两者之间没有显著性差异。结果见表1~2。表1 不同浓度芒果苷磺酸钠和芒果苷作用72h对K562 细胞增殖的影响　　3.2 芒果苷磺酸钠对荷瘤小鼠生存期的影响对于瘤有细胞K562的白血病小鼠，ip时，芒果苷磺酸钠高、中、低3个剂量组与模型组比较，均能延长白血病小鼠的存活天数(P<0.01)，其生命延长率分别为124.5%，74.6%和42.1%。ip时,芒果苷磺酸钠高剂量组(200 mg/kg)与环磷酰胺阳性组(20 mg/kg)比较，对白血病的生命延长率没有显著差异，生命延长率分别为124.5%和129.8%，结果见表3表2 500 μg/ml芒果苷磺酸钠和芒果苷作用不同时间对K562细胞增殖的影响表3 芒果苷磺酸钠对荷瘤小鼠生存期的影响
       4 讨论
       慢性粒细胞白血病(CML) 是一类起源于造血干细胞的克隆性恶性疾病, 其典型特征之一是增殖失控, 造成大量白血病细胞积累, 浸润骨髓及邻近组织并导致骨髓正常造血功能紊乱。因此, 如何控制肿瘤细胞的无限增殖能力, 是肿瘤治疗中的首要问题。
       本研究结果证明, 芒果苷经结构修饰为芒果苷磺酸钠后，能显著抑制慢粒白血病K562细胞的增殖。尽管在一定程度上降低了芒果苷对白血病细胞K562的抑制活性，但两者比较并没有显著差异(P>0.05)。由于芒果苷磺酸钠改善了芒果苷的水溶性，这对提高芒果苷的生物利用度和改变体内给药途径具有指导意义，体内抗肿瘤试验表明，芒果苷经腹腔注射给药能延长白血病小鼠的生命延长率，并且其药效呈剂量依赖，证实了芒果苷磺酸钠抗白血病的有效性和可靠性，提示芒果苷磺酸钠有可能开发成为抗白血病的新药，其抗白血病作用的具体机制还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　[1] 黄海滨，李学坚，梁秋云.RP-HPLC法测定芒果叶中芒果苷的含量[J].中国中药杂志，2003，28(9)：839.
       
       [2] 马玉花，纪兰菊，吉文鹤，等.栽培川西獐牙菜中6种药用成分的测定方法和动态积累研究[J].西南植物学报，2005，25(2)：393.
       
       [3] 邓家刚，曾春晖.芒果叶及芒果苷30年研究概况[J].广西中医学院学报， 2003, 6 (2)： 44.
       
       [4] 程 鹏，彭志刚，杨 杰，等.芒果苷对白血病K562细胞端粒酶和凋亡的影响[J].中药材，2007，30 (7)： 802.
       
       [5] 刘 衡，符仁义，李丰益，等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对HL-60细胞和K562细胞的抗肿瘤作用[J].中国实验血液学杂志，2005，13(6)：964.