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       【摘要】 
       目的研究白藜芦醇(RSV)对于异抗原刺激下大鼠T淋巴细胞活化增殖的影响。方法建立SD-Wistar大鼠腹腔异位心脏移植模型急性排斥反应模型，分离受体脾脏淋巴细胞与成年供体系SD大鼠心肌细胞体外混合培养，分别给予不同剂量RSV与CSA干预，观察RSV与CSA对体外混合培养下T淋巴细胞增殖的影响;通过ELISA法检测两者对细胞因子IL-2的影响。结果RSV可以抑制共培养细胞中T淋巴细胞增殖，减低培养上清中IL-2活性，作用强弱表现出明显的剂量依赖性，与CSA有协同性。结论RSV在体外淋巴细胞培养中表现免疫抑制作用。
       【关键词】  白藜芦醇; 异抗原; T淋巴细胞增殖活化
       白藜芦醇(resveratro, RSV)含芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖的根茎提取物，具有广泛的生理药理学作用，但对免疫系统的调节作用研究较少，我们初步探讨了RSV对异抗原刺激下T细胞活化、增殖与分化的抑制作用。
       1 材料
       1.1 试药与仪器白藜芦醇、大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒、胶原酶均购自Sigma公司;GIBCO1640培养基购自Invitrogen 公司;酶标仪，BMG公司产品;细胞培养箱，Heraeus公司产品。
       1.2 动物供体采用健康纯系清洁级SD大鼠，体质量约180～220g，雌性，购于西安交通大学动物实验中心;受体选用健康纯系清洁级Wistar大鼠，雄性,体质量约180～220g，购于北京试验动物中心。
       2 方法
       2.1 SD大鼠对Wistar大鼠异位腹腔心脏移植模型的建立供受体术前禁食8~12 h,自由进水。供受体麻醉采用氯安酮(50mg/kg)腹腔注射，手术在清洁条件下进行。
       2.1.1 供体手术SD大鼠麻醉后, 由下腔静脉全身肝素化后,于胸主动脉根部切断主动脉及下腔静脉, 将心脏、肺脏以及胸腺组织联合切取。
       2.1.2 供心体外修剪及心脏保存供心置于0~4℃无菌乳酸林格氏液修整, 分离升主动脉及肺动脉, 游离并结扎左肺动脉,游离保留右肺动脉,长度约6～8 mm作为流出道。将胸主动脉干上左颈总动脉分支(第2分支)修剪保留至约3 mm,做为流入道,并将胸主动脉远端结扎，上、下腔静脉和所有肺静脉一次集束结扎。制作直径为3 mm的Cuff套管,将右肺动脉穿过套管,并将动脉近端翻转包绕Cuff套管,丝线结扎固定，经Cuff套管经右肺动脉使用0~4℃无菌乳酸林格氏液供心灌注驱血。
       2.1.3 受体手术Wistar大鼠麻醉后, 左腹部T形切口, 游离左肾动、静脉, 近肾门处切断左肾动静脉, 左肾切除。供心左颈总动脉与受体左肾动脉以袖套法吻合，受体左肾动脉末端套入供心左颈总动脉(第2分支)，将供心右肺动脉Cuff套管插入受体左肾静脉结扎固定。依次开放左肾动脉、左肾静脉，供心节律性收缩后，关腹，自由进食饮水。
       2.2 受体Wistar大鼠淋巴细胞分离与培养
       2.2.1 受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液制备术后第7天，处死大鼠消毒后,无菌开腹取脾，Hanks液洗涤，剪碎脾脏、研磨，过40目滤网，制备受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液。
       2.2.2 淋巴细胞分离与培养受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液淋巴细胞分离液分离。Hanks液洗涤两次，RPMI1640培养液将细胞配成5×106/ml的细胞悬液备用,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育。
       2.2.3 大鼠心肌细胞原代培养及模型建立[1]无菌解剖供体系SD大鼠心脏，经Langendorff灌注架37℃连续灌注无钙台氏液 60 ml, 消化酶30 ml循环灌注12 min，再用含0.06 mol/L Ca2+的台氏液60 ml灌注。在含100 μmol/L Ca2+的KB液中剪碎心脏，37℃轻摇10 min，200 μm滤网过滤，将滤液900 r/min离心1 min，弃上清，加入含500 μmol/L Ca2+的KB液900 r/min离心1 min，再用含1 mmol/L Ca2+的KB液重复1次, 用差速贴壁分离法纯化并于血细胞计数板上计数, 1640完全培养液调细胞浓度为2×107/ml。分两培养瓶，其中一瓶内加入丝裂霉素(25 mg/ml)去增殖活性备用。
       2.2.4 大鼠脾细胞悬液加入经丝裂霉素处理的大鼠心肌细胞共培养用1640完全培养液配成1×106/ml的大鼠脾细胞悬液100 μl加入1640完全培养液调配成浓度为2×107/ml大鼠心肌细胞培养液100 μl，加IL-2(20 U/ml)加双抗(青霉素100 mg/L,链霉素100 万U/L)。
       2.3 实验分组每孔加入不同浓度RSV、CSA培养,A:空白; B: CSA 100 nmol/L;C1: RSV 50 μmol/L; C2: RSV 100 μmol/L; C3: RSV 25 μmol/L; D: CSA 100 nmol/L, RSV 50 μmol/L; E: CSA100 nmol/L, RSV 37.5 μmol/L。
       2.4 实验组内加入不同干预药物共培养细胞中T淋巴细胞增殖抑制率各试验组共培养5 d后。吸取细胞悬液，离心收集上清液, 置-20℃冰箱保存备用,进行IL-2活性测定，分离淋巴细胞，RPMI-1640不完全培养液洗涤2次, 加入RPMI-1640不完全培养液5 ml, 将淋巴细胞悬液通过尼龙柱除去B淋巴细胞，贴壁法去除单核细胞，完全培养液配成5×106/ml,设阴性对照孔(RPMI-1640不完全培养液)，每孔反应总体积100 μl，每孔设4个复孔，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),培养4h,然后加入DMSO 150 μl,充分振荡后,全自动酶标仪490 nm波长进行比色分析，测定此波长下的光密度值OD值，T淋巴细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值- 空白OD )/(阴性对照组OD值- 空白OD)]×100%。
       2.5 IL-2活性的测定 无菌制备活的正常未手术Wistar大鼠脾淋巴细胞,制成5×106/ml细胞悬液,加入ConA使其终浓度为5 μg/ml,置37℃,5%CO2培养箱中培养48 h,收集细胞,离心洗涤2次,用完全RPMI1640配成0.5×105/ml细胞悬液,作为检测IL-2活性的反应细胞。
       取-20℃保存的IL-2上清液,并做1/2和1/4的稀释,在96孔平底培养板中,每孔加入IL-2上清液或不同稀释度的IL-2的上清液100 μl及上述作为反应细胞正常未手术Wistar大鼠脾淋巴细胞100μl，对照组不加IL-2上清,加100 μl 1640培养液。每组各设5个复孔,置37℃,5%CO2培养箱中培养48h,每孔加MTT(5 mg/ml)10 μl,继续培养4h吸100 μl上清液,加入酸化异丙醇100 μl(0.01 mol/L),充分振荡10 min后,全自动酶标仪用560nm波长进行比色分析。
       2.6 统计学分析本实验数据采用统计软件包SPSS12.0处理，以±s表示，多样本单因素方差分析(one way-ANOVA)， 重复资料组间比较MANOVA检验，P<0.05认为具有显著性差异。
       3 结果
       3.1 加入不同干预药物对共培养细胞中T淋巴细胞增殖抑制率的影响结果见表1表1 实验组内加入不同干预药物共培养细胞中T淋巴细胞增殖抑制率　　3.2 加入不同干预药物对共培养细胞上清中IL-2活性的影响见表2表2 实验组内加入不同干预药物共培养细胞上清中IL-2活性的测定
       4 讨论
       异位腹腔心脏移植是一种简便、实用、有效的观察排斥反应发生机制的动物模型，一直用于器官移植后的免疫排异反应研究。 SD与Wistar大鼠为封闭群大鼠, 是一种高排斥反应的组合，SD→Wistar的同种异体移植可以引发强烈的急性排斥反应, 本实验移植模型术后5日移植心脏镜下：移植心脏组织内排斥反应的强度(Standford标准分级)2级及其以上53例(60例)。
       本实验首先建立SD-Wistar大鼠腹腔异位心脏移植模型，5 d后取已发生急性排异反应受体Wistar脾脏分离脾细胞(单个核细胞)作为反应细胞，同时分离供体系SD大鼠单个心肌细胞经丝裂霉素C处理后作为刺激细胞,体外持续刺激受体Wistar脾脏分离脾细胞，作为心脏移植后急性排异反应的体外模型，观察RSV对T淋巴细胞的作用。
       脾细胞中含有大量的单个核细胞, 而后者含有大量的树突状细胞和巨噬细胞，当混合培养MHC抗原(主要组织相容性抗原)不一致时，它们作为抗原呈递细胞(Antigen presented cells，APC)激活T辅助(Th)细胞,同时释放IL-1,进一步激活Th细胞,出现增殖,分化,产生细胞毒T细胞(CTL)破坏心肌细胞, 产生效应T淋巴细胞释放IL-2、γ-IFN、TNF等,促进心肌细胞表面表达MHC 类抗原,MHC 类抗原可被CTL识别而导致心肌细胞的破坏,MHC 类抗原可激活Th细胞,促进T细胞增殖、分化,正反馈性加强上述反应,产生急性排异反应，最终结果为对心肌细胞的杀伤和淋巴细胞的大量增殖，模拟了体内急性排异反应过程[2]。
       本实验也观察到该模型的确可引起T细胞增殖以及细胞因子的改变，达到了模拟心脏移植后体内急性排异反应的目的。CSA及RSV在本模型下可以改变T细胞增殖以及细胞因子的浓度,同时观察到RSV对活化的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，但离体实验中发现其作用强度差于环孢霉素A，其作用有一定的剂量依赖性，但当其离体细胞培养浓度等于或低于25 μmol/L时作用微弱，与空白组无显著性差异，当RSV 50 μmol/L与环孢霉素A100 nmol/L合用时抑制效果优于两者同浓度单用，当联合应用两者时，保持环孢霉素A100 nmol/L培养浓度将RSV浓度减少至37.5 μmol/L时，其抑制效果无显著性差异。
       白细胞介素2(IL-2)主要由活化T细胞分泌产生，而它又促进着T细胞的进一步活化与增殖;IL-2通过自分泌或旁分泌途径与IL-2受体结合而刺激淋巴细胞增殖及IL-2的进一步分泌而起作用，IL-2在急性排斥反应是调节T细胞增殖分化的一个非常重要的细胞因子,IL-2促进移植后免疫排斥反应发生、发展，并妨碍着免疫耐受的成功诱导和维持。本实验观察到RSV对体外混合培养上清中IL-2作用强度弱于CSA，但与CSA合用有明显的协同作用。
       RSV能双向调节T淋巴细胞的增殖,低浓度促进抗CD3、抗CD28所诱导CD8+和CD4+T淋巴细胞增殖,高浓度抑制增殖, 对于CTL细胞的增殖和NK细胞毒活性的激活具有同样的效应。试验中发现RSV (0.75~6 μmol/L)剂量依赖性地促进小鼠T淋巴细胞的增殖和白细胞介素2的产生; RSV (25 mmol/L)能明显抑制T细胞的增殖和溶解细胞的产生[4],抑制IL-2基因的表达。RSV的免疫调节机制比较复杂，可能是几种机制共同作用的结果，也可能还有到现在还未知的其他途径的作用结果[5]。
       【参考文献】
         　[1] 王亭忠，席雨涛，吴格如. 大鼠成体心肌细胞的分离和培养[J]. 第四军医大学学报，2005，25( 17)：1544.
       
       [2] 马涛, 胡 军, 蔡振杰，等. 体外混合淋巴细胞培养对心脏移植急性排斥反应的监测作用[J].第四军医大学学报，2006，27(1)：27.
       
       [3] Rogers EA.Lympholcine requirements for the development of specific cytotoxic T cells from single precursor[J].EUR J Immunal1991,24(13): 1069.
       
       [4] 黎永胜，文 军.白葵芦醇的药理作用研究进展[J].医学综述，2008，14(3):469.
       
       [5] 周玲芝，尹 进.白藜芦醇酒剂对小鼠免疫功能影响的研究[J].湖南中医药大学学报，2009, 29(1):41.