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       【摘要】 
       目的探讨三七总皂苷对实验性糖尿病性心肌病大鼠心脏谷胱甘肽转移酶(GST)基因表达的影响。方法将50只造模成功的雄性SD大鼠随机分为治疗组30只和空白对照组10只，达美康对照组10只。治疗4周后提取各组心肌组织总RNA通过RT-PCR，以β-actin为内参照对GST基因的表达水平进行检测。结果不同剂量三七总皂苷组GST基因表达上调，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论三七总皂苷能够诱导GST基因表达，催化谷胱甘肽与亲电子物质发生结合反应，改善心肌细胞能量代谢，减轻心肌损害。
       【关键词】  三七总皂苷; 糖尿病性心肌病大鼠; 谷胱甘肽转移酶类; 基因表达
       糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)自1974年由Hamby等首次提出以来，病因研究已深入到分子遗传、基因水平。对其发病机制已从代谢紊乱、收缩机制异常、微循环障碍、自主神经病变等多角度进行了深入研究。三七总皂苷(PNS)是中药三七的主要有效成分, 是防治心血管疾病的一种有效药物。为了深入探讨三七总皂苷对糖尿病性心肌病大鼠心脏超微结构的影响及基因分子水平上的作用机制，本实验进行了该方面的探讨。
       1 材料与仪器
       1.1 主要试剂和设备链脲佐菌素为美国Sigma公司产品，RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品;逆转录酶(AMV-RT )，核糖核酸酶抑制剂(RNasin)，dNTP，Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)，随机引物(Random primers)，琼脂糖(agarose)均购自美国Promega 公司。德国产Leica 800型冰冻切片机;美国产Tracor Northern 8502型图象分析仪;日本产日立H-600透射电镜。
       1.2 药物三七总皂苷片，由浙江维康药业有限公司生产。达美康( Gliclazide)，法国施维雅公司产品。
       2 方法
       2.1 动物分组及处理选取52只雄性Sprague Dawley大鼠，给予腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)，连续注射10周，5周后血糖浓度持续大于16.6 mmol/L，表明已建立糖尿病模型。10周后，将2只糖尿病大鼠处死，取部分心肌组织做电镜检查，发现线粒体变性，肌纤维收缩带形成，表明已建立糖尿病性心肌病动物模型[1]。将50只造模成功的雄性SD大鼠随机分为治疗组30只和空白对照组10只，达美康对照组10只。治疗组分为PNS低、中、高剂量组各10只，分别给予腹腔注射不同剂量(PNS 50，100，150 mg·kg-1·d-1)，空白对照组给予腹腔注射同等量的蒸馏水，达美康对照组给予腹腔注射达美康悬浮液20 mg/kg体重。经处理后作病理切片，分别观察不同剂量的三七总皂苷和对照组空腹血糖(FBG)，在光镜下和电镜下观察大鼠心脏超微结构的变化，包括心肌、心肌间质、心肌内中小血管的变化，电镜下心肌细胞超微结构、心脏微血管的变化。
       2.2 心肌组织总RNA的提取 治疗4周后将大鼠处死，取心肌组织约100 mg，用Trizol试剂抽提组织总RNA，紫外分光光度计测A260及A280，要求A260/ A280比值介于1.8~2.0之间，根据A260计算总RNA含量，1%琼脂糖电泳观察总RNA的质量。-20 ℃保存备用。
       2.3 RT-PCR[2]反转录体系为总RNA 2 μg，随机引物 1 μl，70℃ 5 min，立即冰上冷却，加入10 mmol/L dNTP 1.25 μl。5×buffer 5 μl，M-MLV逆转录酶2 μl，加无Rnase水至总体积25 ml，混匀，37℃ 60 min，然后70 ℃ 5 min，-20℃保存备用　GST引物，上游：5’-AGAAGACCACAGCACCAGCA-3’,下游：5’-AGAGAGAACCAGGAGCCACA-3’，片断长度790 bp; β-actin引物，上游：5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’,下游：5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’，片断长度540 bp;PCR在94℃ 45 s，58℃ 30 s，72 ℃1 min 45 s条件下合成，循环35次，产物于1.5%琼脂电泳后紫外灯下摄影，同时测目的带灰度值，与β-actin比较进行半定量。
       2.4 统计学处理所有数据用SPSS11.5软件处理。实验数据以±s表示，组间t检验、F检验比较。
       3 结果
       3.1 空腹血糖(FBG)结果见表1。造模10周、治疗4周时，空白对照组的空腹血糖为(20.35±3.28) mmol/L， PNS各剂量组与空白对照组相比均显著降低(P<0.01)，与达美康组相比差异有显著性(P<0.05)，说明中药PNS有降糖作用，降糖作用的强弱与剂量关系不大，但其降糖作用没有达美康作用强。表1 空腹血糖的比较
       3.2 对谷胱甘肽转移酶(GST)基因表达的影响结果见表2。造模10周、治疗4周时，空白对照组的GST基因表达明显下降，PNS各剂量组的GST基因表达明显上调，与空白对照组相比差异有显著性(P<0.05)，高剂量组与低剂量组相比差异无显著性意义(P>0.05)，高剂量PNS组与达美康组相比其上调明显高于达美康组，差异有显著性(P<0.05)表2 三七总皂苷对糖尿病性心肌病大鼠心肌GST基因表达的影响
       4 讨论
       糖尿性心肌病的发病机制尚未完全阐明，目前研究表明氧化应激相关基因[如谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]和能量代谢相关基因[如磷酸果糖激酶 1(Pfka)、苹果酸脱氢酶(mMDH)等]的表达异常与本病密切相关[3]。谷胱甘肽转移酶是谷胱甘肽代谢中的重要酶，谷胱甘肽是一种抗氧化剂和自由基清除剂，起到清除过氧化物的作用，谷胱甘肽转移酶在体内可起到清除反应氧中间产物(reactive oxygen intermediates , ROS)的作用。近年研究发现ROS在糖尿病慢性并发症发生、发展中起着十分重要的作用，在糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中谷胱甘肽转移酶表达下降，提示病变心肌抗氧化能力降低，加上糖尿病情况下常有主要以葡萄糖及糖化蛋白自动氧化所致的ROS产生增加，引起ROS在心肌组织中过多聚集[4]。
       三七总皂苷(PNS)是中药三七的主要有效成分，具有活血祛瘀、通脉活络的作用。近年来研究证实PNS具有多方面的生物活性，是防治心血管疾病的一种有效药物。其作用主要表现在强心、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面,并且PNS能在细胞水平保护心肌细胞缺血损害，保护心肌超微结构，同时PNS有降血糖作用[5，6]。本实验中各剂量组PNS能够明显降低糖尿病性心肌病大鼠的血糖，具有一定的降血糖作用，但其作用与剂量无关且没有达美康效果显著;同时PNS能够使GST基因表达显著上调，与空白对照组及达美康组相比有显著性差异(P<0.05)。各剂量PNS组GST基因表达均显著升高，推测其在基因水平通过上调GST基因表达，催化谷胱甘肽与亲电子物质发生结合反应，抗氧化，清除自由基，改善了心肌细胞的能量代谢，从而达到减轻心肌损害的作用[7]。
       【参考文献】
         　[1] Thompson EW. Structural manifestations of diabetic cardiomyopathy in the rat and its reversal by insulin treatment[J]. Am J Anat, 1988,182(3): 270.
       
       [2] 谭红梅，吴伟康，罗汉川，等.四逆汤对缺血心肌谷胱甘肽S转移酶基因表达的影响[J].中国病理生理杂志，2002，18(4):413.
       
       [3] 陈 刚，林丽香，庄维特，等.糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中氧化应激相关基因和能量代谢相关基因的表达及其意义[J].中国糖尿病杂志，2003，11(3)：196.
       
       [4] 陈 刚，林丽香，庄维特，等.用基因芯片技术研究糖尿病性心肌病大鼠心肌组织的部分基因表达谱[J].中华心血管病杂志，2002，30(8)：493.
       
       [5] 马 珂.三七皂甙的实验研究进展[J].浙江中西医结合杂志，2002，12(2)：197.
       
       [6] 何 晶.三七的药理作用及研究进展[J].天津药学，2004，16(5)：58.
       
       [7] 段沁江.谷胱甘肽S转移酶与肝脏病变研究进展[J].国外医学·卫生学分册，1995，22(1)：8.