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       【关键词】  吴茱萸；,,高效液相色谱；,,指纹图谱
       摘要：目的研究吴茱萸药材高效液相色谱 （HPLC）指纹图谱的测定方法。方法Alltima C18柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）；流动相∶乙腈∶甲醇∶水（2.0%四氢呋喃+0.4%醋酸）=45∶3∶52；检测波长：225 nm；流速：1.0  ml/min；柱温：25℃。结果HPLC指纹图谱共有8个色谱峰 (RSD≤3%)，符合有关规定。结论所建立的 HPLC指纹图谱为吴茱萸的质量控制提供了更全面的信息,并为吴茱萸及含吴茱萸药材的中成药指纹图谱研究奠定了基础。
       关键词：吴茱萸；  高效液相色谱；  指纹图谱
       The Study of HPLC Fingerprint of Fructus Evodiae
       MO Shanlie, LI Zhan,OU Ying, WEI Song,SI Xiuling
       （Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530001，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the HPLC fingerprint of Fructus Evodiae. MethodsChromatographic conditions included Alltima C18 column and the mobile phase composed of a mixture of acetonitrile carbinol water. Detection wavelength at 225nm. The mobile phase flow rate was 1.0 ml/min. ResultsThe HPLC fingerprint consisted of 8 peaks(RSD≤3%)，and reached to some relevant provision. ConclusionThe method can provide more information for the quality control of Fructus Evodiae, and it may be practically valuable for the quality control of sample for Fructus Evodiae and it"s preparation.
       Key words：Fructus Evodiae；  HPLC；  Fingerprint
   
　　吴茱萸为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸Evodia rutaeca(Fuss.)Benth.，石虎Evodia rutaeca(Fuss.)benth.var.officinab(Dode)Huang及疏毛吴茱萸 Evodiarutaeca(Fuss.) Benth.var.bodinieri(Dode)的干燥近成熟果实。具有温中散寒、疏肝止痛之功效。中医论述吴茱萸的性味辛、苦，热；有小毒。归肝、脾、胃、肾经。常用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻等症的治疗［1］。近年来，国内众多研究工作者尝试采用各种方法致力于中药质量控制方法研究，并提出许多非常有意义的见解和观点。目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的手段，其根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析,而不是求索细枝末节。谢培山认为中医药理论和实践的非线性特点要求综合评价中药质量，色谱指纹图谱(图像)分析是对中药及其制剂进行综合宏观分析的可行手段之一。目前，多用吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量控制吴茱萸的质量，但这样不能全面反映吴茱萸中其他成分的情况，难以真正控制其质量。鉴于中药具有复杂的化学成分，而其活性成分常常不明确的状况，本文应用 HPLC方法，建立了吴茱萸的 HPLC指纹图谱分析方法。
       　　1  仪器与试药
       仪器美国Agilent 1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器；Alltima C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱分析柱；超声仪 B5200S-DT；乙腈、四氢呋喃和甲醇为色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)；乙醇和醋酸为分析纯（汕头市天华化学厂）；吴茱萸碱和吴茱萸次碱购于中国药品生物制品检定所。实验中所用吴茱萸采自广西博白 (No.1)、广西龙州 (No.2)、贵州清镇 (No.3)、广西武宣 (No.4)、贵州铜仁 (No.5)、广西全州 (No.6)、广西河池 (No.7)、广西百色 (No.8)、广西梧州 (No.9)，经笔者签定均为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸 Evodia rutaeca(fuss.)benth.的干燥近成熟果实。
       　　2  方法与结果
       2.1   色谱条件   Alltima C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相∶乙腈∶甲醇∶水（2.0%四氢呋喃+0.3%醋酸）=45∶3∶52；检测波长：225 nm；流速：1.0 ml・min-1；柱温：25℃。进样量：供试品溶液与对照品溶液各20 μl；理论塔板数以吴茱萸碱和吴茱萸次碱计都不少于4 000。
       2.2   对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱和吴茱萸次碱，加甲醇制成每毫升甲醇含吴茱萸碱2.2 mg，吴茱萸次碱1.2 mg的溶液作为对照品溶液。
       2.3   供试品的制备  称取吴茱萸10 g用100 ml乙醇超声提取30 min，过滤，滤液减压回收溶剂至干，甲醇溶解并定容至25 ml,取溶液过0.45 μm微孔滤膜为供试品溶液。
       2.4   方法学考察
       2.4.1  稳定性实验 取药材样品号为 No.5的药材，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在0，4，8，12，20 h进样5次检测指纹图谱，1次20 μl。结果见表1。结果表明：供试品溶液常温下在20 h内，各色谱峰的相对保留时间和峰面积没有明显的变化，符合指纹图谱的要求。
       表1  吴茱萸的稳定性实验(略)
       2.4.2   精密度实验      取 No.4药材的样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样5次，检测指纹图谱。结果见表2。结果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积基本一致。
       2.4.3  重现性实验 取No.6药材样品5份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并分别测定其色谱图。结果见表3。结果其相对保留时间稳定，峰面积基本一致，说明本方法重现性较好。
       2.5   指纹图谱测定
       2.5.1  指纹图谱及共有峰标定 共有指纹峰的标定：取9批吴茱萸样品，分别按供试品的制备方法处理，在上述色谱条件下，测定其色谱图。其中6号峰保留时间与吴茱萸碱峰保留时间一致，作为参照峰。综合9批样品的色谱图，发现其中有8个峰为9批样品所共有的，因此确定为共有指纹峰；经计算各色谱图中共有指纹峰总面积占所有色谱峰面积的百分比在85～95之间。根据9批样品的平均值，以保留时间与吴茱萸碱峰一致的6号峰为参照峰，标定了8个共有指纹峰及其相对保留时间如：1（0.192~0.200），2（0.216~0.227），3（0.551~0.606），4（0.642~0.643），5（0.699~0.701），6（1.00），7（1.118~1.121），8（1.306~1.307）；各共有指纹峰相对保留时间 RSD在0.05～0.83之间。结果见图1。
       表2  吴茱萸的精密度实验(略)
       表3  吴茱萸的重现性实验(略)
       图1  吴茱萸指纹图谱(略)
       2.5.2   共有指纹峰面积的比值按“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)”中有关注射剂用中药材指纹图谱技术要求［4］，峰面积占指纹图谱色谱峰总峰面积10%以上的共有指纹峰尚需标定其与参照峰峰面积的比值；根据9批吴茱萸的指纹图谱测定结果可知，1和2号峰分离不好，故计算时当作一组峰计算其峰面积；此外3和4号峰也因不能分开因此合并计算峰面积。因此符合条件的色谱峰只有5号峰、 7和8号峰。其峰面积与参照峰(6号峰)峰面积的比值见表4。
       　　3  讨论
       3.1   测定波长选择吴茱萸碱和吴茱萸次碱的对照品用甲醇溶解，用美国Agilent 8453紫外可见分光光度计测得它们的紫外吸收图。结果见图2、图3。从图中可以看到吴茱萸碱在225nm处有最大吸收峰，吴茱萸次碱在345nm处有最大吸收峰，但吴茱萸碱在此处没有吸收，并且查文献可知有人用过210 nm［4］，225 nm［5，6］，260 nm［7］，290 nm［8］4个波长，在DAD二极管阵列检测器试验中选择了210 nm，225 nm，260 nm，290 nm四个波长检测，在前三个波长中出现的色谱峰一样多，但波长225 nm下的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰同时最高，所以选择225 nm测定。
       3.2   参照物的选择研究中发现标准品吴茱萸碱在9.5 min出峰，吴茱萸次碱在12.4 min出峰，因吴茱萸碱在此条件下有最大吸收，且出峰时间在30 min以内，以求符合技术要求(暂行)对药材、中间体、成品的要求［3］，因此确定以吴茱萸碱作为参照物。吴茱萸次碱只做定性观察。以吴茱萸碱标准品核对各指纹谱中的相应组分以及相对峰面积比范围来分析研究样品的内在质量。在实验中发现，9批样品的 HPLC指纹图谱中，各批号样品间共有指纹峰的相对保留时间比较吻合，但部分批号个别峰相对峰面积波动较大，认为可能是产地，采收，干燥等不同导致了吴茱萸中各组分的含量存在差异所致。
       表4  9批样品共有指纹峰面积的比值(略)
       图2  吴茱萸碱紫外吸收图(略)
       图3  吴茱萸次碱紫外吸收图(略)
       色谱指纹图谱是通过对各样品色谱图进行比较，来反映产品化学成分的差异。在指纹图谱相似度计算中，一般将所选取的色谱峰同时作比较计算，反映了指纹图谱的整体相似性，可对中药产品质量作出较全面、准确地评价［9~11］。实验研究结果表明：在药材产地，采收，干燥方法等相对固定的前提条件下，利用 HPLC色谱指纹图谱来控制吴茱萸的质量优劣是切实可行的，它比现行质量标准要更全面、客观，该法为吴茱萸的质量控制提供了更全面的信息。
       　　参考文献：
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       ［3］  国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药,2000,22(10):672.
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       ［11］  侯小平，何新新，苏薇薇.中药指纹图谱质量控制技术［J］.中药材,2001,24(5):370.

　　(广西中医学院药学院，广西  南宁   530001)