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       【摘要】 
       目的探讨不同季节乌杨梅叶部精油成分与抗氧化活性的差异。方法采用GC-MS联用技术结合Kovats保留指数对比法分析了春夏两季乌杨梅鲜叶精油的成分， 运用DPPH自由基清除法、β-胡萝卜素漂白法和硫代巴比妥酸法对精油抗氧化活性进行了综合对比分析。结果春季精油产量(0.13%)高于夏季(0.05%)，春季精油成分以倍半萜烯含氧衍生物为主(占52.69%)，夏季精油则以倍半萜烯为主(占70.04%)，其中5-羟基白菖烯是变化差异最为显著的特征成分。春季精油表现出优良的脂质抗氧化和清除DPPH自由基活性，而夏季精油仅表现出有限的脂质抗氧化能力。结论杨梅叶精油产量和品质随季节而变化, 春夏两季精油的抗氧化活性差异可能与它们特征组分的相对含量存在显著差异有关。
       【关键词】  乌杨梅; 芳香精油; 季节变化; 抗氧化活性
       杨梅Myrica rubra Sieb. et Zucc.系杨梅科(Myricaceae)，是原产于中国的亚热带树种，我国有6个种[1]。杨梅可药食两用，宋代《食疗本草》和明代《本草纲目》对杨梅的药用功效均有记载。杨梅的枝叶、根、皮在中国大陆、台湾地区和日本等地常用作收敛剂、解毒剂和肠胃止泻剂等传统中药成分[2]。二十多年来，日本和我国学者对杨梅枝叶溶剂萃取物的药用成分进行过较深入研究，先后分离出杨梅素、单宁、三萜和二芳基庚萜化合物等几类活性成分[3~6]，近年来还分离得到两种具有抗肿瘤活性的香豆素衍生物等成分[7，8]。药理研究表明杨梅叶甲醇萃取物可治疗NO、CCl4-和α-萘基异硫氰酸酯诱导的肝损伤，50%乙醇萃取物可抑制体内黑色素的合成[9，10]。杨梅属于芳香植物，近年来相继开展了针对不同属杨梅叶芳香精油的分析和生物活性研究。本作者[11，12]对分布于南岭自然保护区内乌杨梅树不同药用部位的精油成分及其生物活性也进行了系统研究，发现其具有优良的抗氧化和抗食源性致病菌活性，精油特征成分及含量与矮杨梅[13]、丁岙杨梅[14]及东魁杨梅[15]叶部精油存在较大差异。芳香精油的产生与植物的生理和生长环境条件高度相关, 同种芳香植物因生长环境的差异，精油含量和品质差别显著，而且在不同季节、不同生长期、植株的不同部位，精油及其有效成分含量也不同[16，17]。
       本文对国内南方省份资源丰富的乌杨梅春、夏两季鲜叶芳香精油进行了含量测定，采用GC-MS联用技术并结合Kovats保留指数(KI)对比法对其成分进行了比较鉴定，同时通过国际上普遍采用的3种体外评价方法对其抗氧化活性进行了对比研究，旨在为客观评价其药用价值和保护性开发提供科学的基础数据。
       1 材料与仪器
       1.1 材料乌杨梅M. rubra var.astropurea Tsen.新鲜枝叶由广东南岭国家自然保护区大顶山管理处分别于2006年4月和7月提供，鲜叶均采自同一颗具有15年树龄的大树，采收后速冻处理待用。品种经保护区彭华贵工程师与该自然保护区标本库标本对照鉴定。主要试剂包括：C8-C21系列正烷烃(气相色谱纯，中国医药集团，上海)，亚油酸(Alfar aesar, 德国)，DPPH自由基(2,2′-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Sigma,美国)，AAPH自由基[2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochioride] ( Aldrich，美国)，硫代巴比妥酸(Sigma，USA),　β-胡萝卜素(Sigma，USA)，2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和抗坏血酸均为分析纯。
       1.2 仪器芳香精油测定仪(广州玻璃厂)，气质联用仪(Finnigan TRACE /DSQ，美国热电)，紫外可见分光光度计(916型，澳大利亚GBC)。
       2 方法
       2.1 精油提取与含量测定采用水蒸气同步蒸馏法提取精油。沸蒸回流3 h。精油用无水硫酸钠脱水，过滤后取适量正已烷溶解稀释为1×10-3(V/V)浓度用于气质联用分析。样品测定前均置于-25℃下贮存。
       2.2 气质联用分析GC-MS分析采用韶关学院实验中心TRACE GC/DSQ 气质联用仪完成。GC条件：色谱柱为DB-5石英毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm;载气为高纯氦(99.999%);柱流量1ml·min-1; 不分流进样;进样口温度220℃;传输线温度210℃;进样量1 μl。程序升温，柱温40℃(1 min)-10℃(/min)-200℃(3 min)。MS条件：电离方式EI，电子能量70 eV，发射电流100 mA，离子源温度200℃，质量扫描范围50-350 m/z，溶剂延迟4 min。C8-C21系列正烷烃均以1×10-3(V/V)浓度用正己烷溶解，与上述GC条件一样进样测定。杨梅叶精油被GC分离的各成分用下面的线性升温公式计算其KI[18]：KI = 100n + 100( tx-tn )/( tn+1 - tn)其中tx为测定物质的保留时间，tn和 tn+1分别为碳原子数相差为1的正烷烃的保留时间(tn < tx < tn+1)　结果用随机所带的美国NIST Library(2002版)质谱库检索，并与相应标准KI值[18]对比确定，无标准KI值的组分只用质谱库检索结果确定。相对含量的确定采用峰面积归一化法。
       2.3 抗氧化性评价试验
       2.3.1 DPPH自由基清除率测定配制浓度分别为4，8，10，16，24，32 和50 g·L-1的受试样品甲醇液。分别取200 μl与4 ml浓度为6×10-5M DPPH甲醇液混合，于517 nm处测定吸光度，不加样的DPPH甲醇液为空白样。平行样为3个。自由基清除率按下式计算自由基清除率(%)=[(AC(0)–AA(t))/ AC(0)]×100%其中AC(0)为t = 0 h时的空白样吸光度值;AA(t)为t= 1 h时样品吸光度值。
       2.3.2 β-胡萝卜素漂白试验法将β-胡萝卜素(0.1 mg)用氯仿(10 ml)于梨形瓶中溶解，加入亚油酸(20 mg)和吐温40(100 mg)，然后于50℃旋转真空干燥。加入50 ml含氧蒸馏水，于超声波中形成乳化液A。取200 μl浓度分别为4，8，12，16和20 g·L-1的受试样品乙醇液与5 ml乳化A液于试管中混合，不加样品的用等量乙醇代替与A液混合作为空白样。在50℃保温，于470 nm测定吸光度。平行样为3个。抗氧化率用下式计算抗氧化率(%) = [(AA(120) – AC(120))/( AC(0) – AC(120))]× 100%其中AA(120)为t = 120 min时的样品吸度度，AC(120)为t = 120 min时空白样吸光度值，AC(0)为t = 0 min时的空白样吸光度值。
       2.3.3 硫代巴比妥酸法分别取0.1ml浓度为5，25，50 g·L-1的样品甲醇液与0.5 ml蛋黄乳浊液混合，加入50 L的AAPH自由基溶液(0.07mol/L)引发脂质过氧化反应。随后即加入1.5 ml乙酸溶液(20%)和1.5 ml浓度为0.8%硫代巴比妥酸液[用1.1% (W/V) 十二烷基硫酸钠溶液配制]，振荡均匀。不加精油样品的为空白样。然后于95℃水浴保持60 min。冷却后，每个试管中加入5 ml正丁醇，充分萃取，于1 200 g离心15 min。倾出有机层在532 nm处测定吸光度值。平行样为3个。抗氧化指数用下式计算抗氧化指数(%) =[(AC(0) – AA(t))/ AC(0)]× 100%其中AC(0)为空白样t = 0 h吸光度值，AA(t)为样品t = 1 h吸光度值。
       2.4 数据处理与统计分析数据处理和统计分析采用SPSS10.0软件。相同受试浓度水平下各受试物的抗氧化率之间两两差异显著性分析比较用邓肯氏极差法(P<0.01)。
       3 结果
       3.1 精油的GC-MS分析采用水蒸气同步蒸馏法测得乌杨梅春季鲜叶精油含量为0.13%±0.04% (V/W)、夏季为0.05±0.01%(V/W)。精油均呈柠檬黄色，无刺激性，相对密度为0.9280 mg·ml-1。春、夏两季乌杨梅叶部精油的气相色谱总离子流图如图1所示。分别对2种精油中相对含量≥0.05%的41和36种成分进行了鉴定，被鉴定的组分相对含量总和分别为相应精油的97.30%和99.97%。结果见表1春、夏两季杨梅叶部精油的化学组分基本为倍半萜类(分别为92.77%和97.78%)。春季精油以倍半萜烯含氧衍生物为主(占52.69%)，而夏季精油则主要以倍半萜烯为主(占70.04%)。两季精油中化学组成没有明显变化，但其主要成分的含量存在较大差异。这种变化主要表现在：夏季精油中的倍半萜烯异石竹烯和石竹烯含量(分别为24.21%和26.47%)比春季精油明显高得多(分别为10.17%和11.61%)，而大根香叶烯A、α-依兰油烯、α-金合欢烯等倍半萜烯成分在两季节则变化不大;随着季节的更替，5-羟基白菖烯在鲜叶中的含量出现显著变化，其在春季精油中的含量高达30.44%，而夏季精油中的含量则仅为1.81%。此外，春、夏两季精油中均含有较高量的(E)- 橙花叔醇(分别为9.57%和16.65%)。
       3.2 精油抗氧化性对比分析
       3.2.1 DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除法可适用于亲脂性和亲水性质子供体的活性检测。本研究选用脂溶性的BHT、弱脂溶性的PG和水溶性的抗坏血酸3个强抗氧化剂为参照，对比了春、夏两季乌杨梅叶部精油的DPPH自由基清除效果。如图2所示，BHT、PG和抗坏血酸均表现极强的DPPH自由基清除活性，三者在各受试浓度下的DPPH自由基清除率之间不存在显著差异(P≥0.01)。本实验测定它们的自由基半清除浓度IC50分别为0.014，0.018和0.013 g·L-1。总体而言，春、夏两季乌杨梅叶精油的DPPH自由基清除能力均随受试浓度升高而增强，春季叶部精油自由基清除活性表现优良，其IC50约为0.061 g·L-1，而夏季叶部精油DPPH清除活性较弱，在本实验条件下未能测出自由基半清除浓度，两季精油的DPPH自由基清除能力存在显著性差异(P<0.01)。DPPH自由基是依靠能抗氧化剂提供·H而中和的，作为灵敏的质子受体，通过观察质子供体与其反应的速度也能判断受试物抗氧化活性的强弱。在实验过程中也观察到，在相同浓度时春季杨梅叶部精油清除自由基的的反应速度比夏季精油反应速度快得多。导致这种现象的根本原因可能与5-羟基白菖烯在两季精油中的含量显著差异有关，作者曾测到从春季乌杨梅叶部精油中分离的5-羟基白菖烯单体具有极强的DPPH自由基清除能力[12]。A-春季样 B-夏季样图1 春、夏两季杨梅树叶部精油气相色谱总离子流图
       3.2.2 β-胡萝卜素漂白抑制活性β-胡萝卜素漂白试验法主要评价的是抗氧化物质在乳化脂质体系中抑制脂质氢过氧化前期反应的能力。图3为采用β-胡萝卜素漂白试验法测定的乌杨梅叶部精油与抗氧化剂BHT、PG和抗坏血酸的抗氧化效果对比。在脂质体系中醇溶性的BHT是公认的强抗氧化剂，在本试验条件下，BHT再现出极强的抗氧化性，其半抑制浓度IC50约为0.083 g·L-1。值得一提的是作为强抗氧化剂的水溶性抗坏血酸几乎不显现其抗氧化活性，而且与浓度无相关性，弱水溶性的PG也未能测出其IC50值，与BHT存在极为显著的差异(P<0.01)。这种现象称为脂质体系中的“极性反常”(Polar paradox)，已被许多研究者所证实[19]，其原因是由于水溶性极性物质在乳化脂质体系中主要集中在水相，而脂相中的浓度极低。春、夏两季杨梅叶部精油在高浓度时也表现出较好的抑制β-胡萝卜素漂白的活性，它们的IC50分别约为0.177和0.264 g·L-1，不存在显著性差异(P≥0.01)。表明它们抑制脂质氢过氧化前期的能力相近，呈现抗氧化能力的成分主要是脂溶性成分，即春季精油中高含量的5-羟基白菖烯、异石竹烯和石竹烯等特征成分，以及夏季精油中高含量的异石竹烯和石竹烯等特征成分是主要的脂质抗氧化物质。
       3.2.3 硫代巴比妥酸法脂质抗氧化指数硫代巴比妥酸法主要衡量的是抗氧化剂清除能导致脂质过氧化的自由基的能力，但同时也能衡量弱亲脂性抗氧化剂的抗氧化能力。如表2所示，样品的抗氧化指数均随受试浓度的升高而上升，但有些抗氧化剂在同一受试浓度的抗氧化指数之间的差异极为显著(P<0.01)。采用该法对极性较大的抗氧化剂PG和抗坏血酸进行测试的结果与β-胡萝卜素漂白试验法一样，PG、抗坏血酸与BHT的抗氧化指数存在极为显著的差异(P<0.01)，也表现出“极性反常”现象。春季杨梅叶部精油在受试浓度下与BHT的抗脂质过氧化能力不存在极为显著的差异，尤其是在高浓度下的抗氧化能力接近BHT，而夏季杨梅叶部精油与BHT的抗氧化能力差异显著。春夏两季杨梅叶部精油之间的抗脂质过氧化能力也存在差异，这可能与其化学组成特征成分的含量差异有关。表1 春、夏两季杨梅树叶部精油对比鉴定的成分及其相对含量
       4 结论
       春、夏两季乌杨梅叶部精油中化学组成没有明显变化，但精油的产量和组分的相对含量存在显著差异。春季乌杨梅叶部精油成分以倍半萜烯含氧衍生物为主，其中5-羟基白菖烯是最主要的特征成分;而夏季精油则以倍半萜烯为主，其中异石竹烯和石竹烯是最主要的特征成分。表明杨梅叶部精油产量和品质随季节而变化。
       总体上春季叶部精油的抗氧化活性明显优于夏季叶部精油。春季精油具有较好的DPPH自由基清除能力，在脂质体系氧化前期与后期均表现优越的抗氧化能力;夏季叶部精油的DPPH自由基清除能力较弱，但表现出一定的脂质抗氧化能力。春、夏两季乌杨梅叶部精油的抗氧化能力的差异可能与其特征组分相对含量存在显著差异有关。
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