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       【摘要】 
       目的观察诃子提取物以及含药血清对CCl4引起大鼠肝细胞损伤保护作用，以及保肝作用机理的初步探讨。方法采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，体外采用CCl4(20mmol/L)诱导肝细胞损伤，采用光镜观察、MTT法以及MDA检测，观察诃子提取物以及含药血清的保肝作用，并通过检测相应的抗氧化酶活性对保肝作用进行初步研究。结果诃子提取物及含药血清具有显著的保肝作用，诃子提取物(0.8，1 mg/L)和0.9 g/kg所制备的含药血清能够改善CCl4所引起的细胞形态变化，显著提高细胞活力，能够有效抑制CCl4引起的肝细胞脂质过氧化作用，并提高脂质过氧化酶SOD 和GSH-Px的活性。结论诃子提取物及其含药血清具有保肝作用，这种作用与提高抗氧化酶的活性有关。
       【关键词】  诃子; 肝损伤; 抗氧化
       诃子为常用的中药之一，收载于《中国药典》[1]。诃子是使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz或绒毛诃子Tchebulm Retz var tomentella Kurt的干燥成熟果实，生产于印度及斯里兰卡，我国云南亦有生产。诃子具有涩肠止泻敛肺，降火利咽的功效。诃子的主成分为诃子酸(chebulinic acid)、诃黎勒酸(chebulagicacid)、1, 3, 6-三没食子酰葡萄糖等[2]。近期报道有三帖类、多元酚酸类、脂肪族化合物以及氨基酸、矿物质等成分[3]。对诃子药理作用研究发现诃子具有抗菌、强心、抗氧化以及解痉等作用[4]，另有文献报道含有诃子的复方具有明显的抗肿瘤及抗艾滋病毒活性[5，6]。关于诃子保肝作用的研究，本研究室在先前的动物实验中已有报道[7]。本文采用体外分离大鼠肝细胞进行肝细胞原代培养，用CCl4诱导肝细胞损伤模型，观察诃子提取物(extract of Terminalia chebula Retz，ET )对肝细胞损伤保护作用以及作用机理的初步研究，并为进一步发现活性组分确定体外筛选技术。
       1 材料与仪器
       1.1 药物诃子购自内蒙古凯蒙大药房，经内蒙古医学院药学院植化教研室庞秀生教授鉴定为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz的干燥成熟果实。
       1.2 试剂MTT、Ⅳ型胶原酶购自SIGMA公司，RPMI-1640购自GIBCO公司，CCl4天津市化学试剂三厂生产，GOT购自中生北控生物科技股份有限公司，MDA、SOD、GSH-Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其它试剂均为市售分析纯。
       1.3 动物清洁级Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购自内蒙古大学实验动物中心(动物号YXQ(蒙)2002-0001)。
       1.4 仪器SCOTT-Ⅱ半自动生化分析仪(意大利MENARINI公司)，721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机厂)，MODEL680型酶联免疫检测仪(Bio-Bad LABORATIES,INC)。
       2 方法
       2.1 诃子提取物的制备100g鞣质经3次丙酮提取后(55℃加热回流提取)，弃去残渣，收集合并3次滤液 ，加入等体积的乙醚除杂质，弃去醚层，收集水层，用等体积的醋酸乙酯萃取5~6次，收集醋酸乙酯层，回收醋酸乙酯，在55 ℃水浴蒸干得黄色粉末，研磨备用。
       2.2 诃子含药血清制备大鼠实验前禁食12 h，大鼠20只分为5组，雌雄各半，实验前禁食12 h。空白组每天灌服蒸馏水(2 m1/kg)、诃子含药血清4个不同给药组(剂量分别为0.06，0.3，0.6，0.9g/kg),各组每天给药2次，连续灌服3 d并在最后1次灌胃后2 h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，行腹主动脉无菌采血凝固后，低温离心分离血清，将各组4只大鼠血清混合，置-20℃冰箱保存备用[8]。
       2.3 大鼠肝实质细胞原代培养取Wistar大鼠1只、体质量(200±20)g雌雄不限、先腹腔注射4%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，皮毛消毒后，背位固定在解剖板上，在无菌条件下打开腹腔分离肝脏，找到门静脉和下腔静脉并尽量与周围组织剥离干净，在门静脉近心、远心端以及下腔静脉各穿一根灭菌手术线后，结扎门静脉远心端和下腔静脉手术线，做门静脉插管。先以37 ℃的灌流液以蠕动泵恒速在位灌流，待肝脏肿胀变大后，迅速剪断下腔静脉结扎线的远心端以使灌流液顺畅流出，待预灌流液结束后,更换为Ⅳ型胶原酶灌流液，继续做在位灌流，灌流结束后剪断肝脏与周围组织的连接，将肝脏移至玻璃平皿中用不完全1640培养液清洗，之后小心撕开肝脏包膜轻轻振摇抖落肝细胞成肝细胞悬液。收集悬液于锥形瓶中，37 ℃振荡培养 15min，培养结束后立即置冰水中冷却，100目不锈钢钢网过滤，收集滤液在4℃条件下800 r/min离心 3 min，弃上清，用清洗液按照上述条件清洗离心3次，末次弃上清后，以培养液重悬制成 1×106个/ml肝细胞悬液，用台盼蓝染色，当肝细胞活力大于 85%时用于实验[9]。
       2.4 CCl4致肝细胞损伤模型的建立肝细胞培养36h后，更换培养液并加入CCl4(终浓度为20mmol/L)以少量的DMSO助溶，继续培养1h。
       2.5 MTT法检测诃子提取物及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤保护作用取贴壁生长的肝细胞，设空白组、CCl4模型组、诃子提取均设置4个剂量组(0.4，0.6，0.8，1mg/L);另外设置4个诃子提取物含药血清组，使血清终体积为20%，每组设8个复孔。各组在加入CCl4培养1 h后，分别加入待测药物继续培养6h，在光镜下进行细胞形态学检查，同时每孔加MTT 10 μl，孵育4h，弃去上清，每孔加DMSO 150 μl，振摇10 min，在570 nm处用酶标仪检测吸光度。
       2.6 GOT、MDA、SOD和GSH-Px的检测收集各孔中的细胞，参照试剂盒说明书检测GOT、SOD和GSH-Px以及MDA含量。
       3 结果
       3.1 光镜下观察诃子提取物对于CCl4所诱导损失的保护作用在光镜下观察发现CCl4损伤1h后，肝细胞形态发生显著的变化，镜下可以看到细胞的膜结构被破坏，大量肿胀坏死细胞。而诃子提取物以及含药血清组中对于这种形态改变具有显著的改善作用。
       3.2 诃子提取物以及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤后细胞活力的影响诃子提取各浓度组(0.4，0.6，0.8，1 mg/L)分别作用于肝细胞损伤6h后，由MTT结果可以看出，诃子提取物0.6，0.8，1 mg/L组中与CCl4模型组比较具有明显的保护作用(P<0.01)，而且这种保护作用具有一定的量效关系。见表1将不同剂量制备的诃子含药血清与肝细胞作用6h后，对于CCl4所致的肝损伤具有一定保护作用，在各剂量组中只有在0.9 g/kg具有显著的保肝作用(P<0.05)，其他各剂量组的肝脏保护作用并不显著，结果见表1。
       3.3 诃子提取物以及含药血清对GOT的影响诃子提取物对于CCl4所致的GOT渗出率有很好的抑制作用，可以显著降低GOT的活性，在0.6,0.8,1mg/L 剂量时对CCl4引起的肝细胞损伤具有显著的保护作用(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。在诃子含药血清各组别中，0.9 g/kg时具有显著的作用，显著降低GOT的渗出(P<0.05)。结果见表2表1 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MTT的结果表2 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤GOT的影响
       3.4 诃子提取物及含药血清对肝细胞MDA的影响CCl4损伤后可以导致显著的脂质过氧化反应，使脂质过氧化产物MDA显著升高，诃子提取物在0.6，0.8，1 mg/L时能够显著抑制CCl4所致的MDA升高(P<0.05或P<0.01)，具有显著的抑制脂质过氧化作用。见表3诃子含药血清对于异常升高的MDA具有显著的抑制作用，在剂量组0.6，0.9 g/kg时均具有显著的作用(P<0.05)。见表3。
       3.5 诃子提取物及含药血清对SOD及GSH-Px的影响SOD和GSH-Px是体内重要的抗脂质过氧化酶类，诃子提取物0.6，0.8，1 mg/L能够显著的提高SOD的活性(P<0.05或0.01)，并具有一定的量效关系。对于GSH-Px的活性影响不显著，诃子提取物仅在1mg/L时能够显著的提高GSH-Px酶活性(P<0.05)，而在0.4mg/L时具有显著的降低GSH-Px活性的作用(P<0.01)，可能实验误差等原因所致。见表4。表3 诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MDA的影响表4 诃子提取物对CCl4所致大鼠肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响诃子提取物含药血清在0.3，0.6，0.9 g/kg时能够显著的提高SOD的活性(P<0.05或P<0.01)，同时具有一定的量效关系。诃子提取物含药血清对于GSH-Px活性的影响，在0.6 g/L和0.9 g/L均可以显著的提高GSH-Px酶活性(P<0.05)，而0.06 g/L时则显著的降低酶活性，可能与实验误差有关。结果见表5。
       4 讨论
       诃子是在中蒙药中经常使用的一味药，具有多方面的药理作用。实验中采用CCl4诱导肝细胞损伤的方法，CCl4 是经典的致急性肝中毒试剂。目前，一致认为自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其中毒作用的主要机制。CCl4 在肝细胞内，在细胞色素P-450作用下，产生O 2-·、C C l 3- ·、C C l 3OO-·、·OH 等自由基和H2O2，诱导细胞膜发生脂质过氧化反应，并引发一连串的自由基链反应，从而破坏生物膜结构的完整性，引起膜通透性增高，导致胞内相关酶外释，细胞内氧化还原的平衡状态被打破，最终导致细胞死亡[10]。实验中通过镜检以及MTT法发现诃子提取物以及含药血清对于CCl4诱导的细胞的死亡具有很好的抑制作用，能显著的提高细胞活力。表5 诃子提取物含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响　MDA 是细胞膜脂质过氧化反应的终产物，细胞中MDA 含量多少可反映细胞脂质过氧化损伤程度;SOD和GSH 是细胞内源性重要的抗氧化剂，其含量多少是衡量细胞抗氧化能力大小的重要指标。因此，MDA 生成量与SOD和GSH 含量水平两个指标可直接反映细胞脂质过氧化反应程度。在诃子提取物及含药血清均可以降低MDA的含量并提高SOD和GSH 的活性，以上均提示了诃子的保肝作用与抗脂质过氧化作用有关。
       总之，我们通过体外实验发现诃子的保肝作用与提高抗脂质过氧化作用有关，血清药理学被用于诃子保肝作用的研究中。但是，通过对比发现，可能由于诃子保肝有效成分含量低或在体内生物利用度比较低，导致了诃子提取物含药血清保肝作用并不是很理想。而这些正是下一阶段研究方向，通过本实验中建立成熟的体外肝细胞损伤模型，为筛选诃子保肝作用活性单体并完善相应分子机理奠定基础。
       【参考文献】
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