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       【摘要】 
       目的研究淫羊藿苷对半胱氨酸刺激的兔血管平滑肌细胞增殖的影响，为探讨淫羊藿苷降血脂、预防动脉粥样硬化的作用机制及其药效提供实验依据。方法兔血管平滑肌细胞增殖模型组给予不同剂量淫羊藿苷处理，采用MTT方法测定各组细胞OD值，用流式细胞术分析其细胞周期。并用TUNEL法镜下观察凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果半胱氨酸能显著促进VSMC的增殖(P<0.05),而淫羊藿苷对半胱氨酸刺激平滑肌细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。淫羊藿苷影响了增殖平滑肌细胞的细胞周期,使S期细胞数量减少。淫羊藿苷对增殖的兔血管平滑肌细胞具有促凋亡作用,随药物浓度的增加，细胞的凋亡率增加。结论淫羊藿苷对增殖的兔血管平滑肌细胞有明显的抑制生长及促凋亡作用,在心血管疾病的治疗方面具有重要的研究价值。
       【关键词】  淫羊藿苷; 血管平滑肌细胞; 增殖; 凋亡
       动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是许多心血管病的病理基础，发病过程中血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的增殖始终占主导地位。近些年来,有学者提出了利用药物来促进VSMC凋亡防止其过度增殖,从而治疗动脉粥样硬化的新思路[1~3]。能否通过药物调控VSMC的细胞程序化死亡,将对动脉粥样硬化的治疗具有重要意义。
       淫羊藿苷(icariin,ICA)是从淫羊藿茎叶中提取的淫羊藿总黄酮中的主要有效成分。传统医学认为其具有补肾壮阳、祛风湿、强筋骨等功效，近年来有研究发现其对心脑血管疾病有很高的应用价值[4]。本课题利用同型半胱氨酸(Homocysteinemia, HCY)刺激培养的兔血管平滑肌细胞增殖[5，6]研究淫羊藿苷对其生长的影响，从而为探讨淫羊藿苷抗动脉粥样硬化作用机制奠定重要的实验基础。
       1 材料与仪器
       1.1 药物及试剂淫羊藿苷标准品购自中国药品生物制品鉴定所(批号200312);同型半胱氨酸为Sigma公司产品(批号c-7352) ;胎牛血清为杭州四季青公司产品;胰蛋白酶、DMEM为GIBCO公司产品;In situ Apoptosis Detection Kit、pMD- 19T载体,DNA连接酶等均为宝生物工程(大连)有限公司产品;高纯总RNA快速提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司产品;逆转录试剂盒为Fermentas产品;兔血管主动脉平滑肌细胞VSMC购自中国协和医科大学基础医学院细胞培养中心。
       1.2 仪器美国BD公司FACS420型流式细胞仪,日本奥林巴斯荧光倒置显微镜,Hera CO2细胞培养箱。
       2 方法
       2.1 细胞培养在37℃、含5%CO2的培养箱内，用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养兔血管主动脉平滑肌细胞VSMC,培养基中分别加入终浓度为100 mg/L的链霉素与青霉素,2~3 d传代一次。
       2.2 同型半胱氨酸刺激VSMC增生模型的建立及淫羊藿苷药品的处理将血管平滑肌细胞按1×108/L密度稀释后接种在含20%胎牛血清的DMEM培养基中;细胞分为空白组、同型半胱氨酸模型组、淫羊藿苷高、中、低剂量药物处理组 (每组均为3瓶)。接种12 h后, 同型半胱氨酸模型组、淫羊藿苷处理组均加入终浓度　为10-4 mol/L的同型半胱氨酸,;再培养24 h后,淫羊藿苷各处理组分别加入终浓度为0.4，0.2，0.1 mg·L-1的淫羊藿苷;培养48h后,分别收集细胞。
       2.3 MTT方法测细胞增殖取生长良好的兔血管平滑肌细胞VSMC，用胰酶消化，调整细胞密度至4×104 /ml，接种于5块96孔培养板上，每孔100 μl。常规培养12h后, 空白组加入培养液，同型半胱氨酸模型组、淫羊藿苷处理组均加入含10-4 mol/L同型半胱氨酸的培养液,再培养24 h后,淫羊藿苷处理组分别加入终浓度为0.4，0.2，0.1 mg·L-1的淫羊藿苷。每组设6个复孔。标准环境下分别孵育12，24，36，48 h 后，每孔内加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h。弃去孔内上清液，每孔内加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min后，在酶标仪A492 nm下测定吸光度(OD)值，取6孔平均值，统计学分析,统计方法数据以±s表示，两组均数比较采用t检验。
       2.4 分析细胞周期按照方法“2.2”项处理并收集细胞，1 000 r/min离心10 min，弃培养液;PBS洗涤两次;离心去PBS后加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃避光过夜。800 g 离心10 min，去上清;PBS 清洗两次;重悬细胞于500 μl 含100 u/ml RNaseA 的PBS 液中，37℃孵育30 min;加2 mg/ml PI 至终浓度为50 μg/ml，孵育30 min后上流式细胞仪分析细胞周期。
       2.5 In situ Apoptosis Detection Kit检测凋亡细胞按照方法“2.2”项处理并收集细胞，将收集的细胞按照试剂盒操作说明进行操作，立即在荧光倒置显微镜下观察分析。
       2.6 流式细胞仪分析凋亡细胞按照方法“2.2”项处理并收集细胞，并分别制备单细胞悬液，计数后加PBS重悬，调整细胞浓度为106/ml。取0.5 ml上述细胞悬液，1 000 r/min 4 min离心弃上清，加0.5 ml Binding Buffer重悬。加1μl荧光标记的Annexin V试剂，混匀后避光室温下孵育30 min，加入5 μl PI混匀后4℃孵育5 min,加入500 μl Binding Buffer，立即上流式细胞仪检测。
       3 结果
       3.1 不同浓度的淫羊藿苷对HCY刺激平滑肌细胞增殖的影响见图1。结果表明，从OD值可见模型组与正常组相比，作用时间24h以后，均可显著刺激VSMC的增殖(P<0.05)，含淫羊藿苷的药物处理组与模型组相比，其A值均有不同程度的降低，统计结果显示，除作用时间12 h外，24 h，36 h，48 h的OD值数据与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)，即淫羊藿苷对HCY刺激平滑肌细胞的增殖具有明显的抑制作用，且表现出一定的剂量依赖性，但不同浓度的淫羊藿苷处理组间相比，差异不显著(P>0.05)。图1 不同浓度的淫羊藿苷对HCY刺激平滑肌细胞增殖的抑制作用
       3.2 淫羊藿苷对增殖的血管平滑肌细胞细胞周期的影响分别收集空白对照组、半胱氨酸处理组、淫羊藿苷药物处理组细胞，用流式细胞仪检测细胞周期。结果见表1表1 淫羊藿苷 对VSMC周期分布的影响
       3.3 凋亡细胞的镜下观察利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素断端标记法(TUNEL)检测,可以在荧光显微镜下观察到呈黄绿色荧光的TUNEL阳性细胞，如图2图2 淫羊藿苷诱导血管平滑肌细胞凋亡的荧光染色结果
       3.4 流式细胞仪检测淫羊藿苷诱导血管平滑肌细胞凋亡的结果Annexin V 与PI双染细胞，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果如图3。其凋亡率分别是：空白组为0.11%，同型半胱氨酸组2.09%，淫羊藿苷高浓度药物处理组7.54%，淫羊藿苷中浓度药物处理组6.98%，淫羊藿苷低浓度药物处理组2.88%。
       4 讨论
       动脉粥样硬化发病原因复杂,与内皮损伤、脂质沉积、血栓形成、平滑肌增殖等多种因素有关, 随着研究的不断深入,研究人员发现VSMC增生是其中的一个关键因素[1]。
       本实验采用MTT方法，研究淫羊藿苷对平滑肌细胞在半胱氨酸刺激下增殖的影响。结果表明，淫羊藿苷组对VSMC增殖的抑制作用与模型组相比具有显著差异，且表现出一定的剂量依赖性。说明淫羊藿苷具有降血脂、预防动脉粥样硬化的作用，为进一步开展药物作用机制及其药效学研究提供了实验依据。
       同时,本研究利用流式细胞仪检测了各组细胞周期,结果发现用淫羊藿苷处理后的细胞S期的DNA含量与半胱氨酸组相比明显降低，可能淫羊藿苷药物作用使通过G1/S限制点到达S期的细胞数量比半胱氨酸组少,滞留在G1期的细胞数量则增多,说明淫羊藿苷影响了增殖平滑肌细胞的细胞周期,使其细胞周期滞后。a-空白对照组 b-同型半胱氨酸处理组c-淫羊藿苷高浓度药物处理组 d-淫羊藿苷中浓度药物处理组e-淫羊藿苷低浓度药物处理组图3 血管平滑肌细胞流式细胞术凋亡检测结果
       淫羊藿苷药理作用的微观研究认为，ICA能促进增殖的血管平滑肌细胞凋亡而发挥抗动脉粥样硬化作用[4，7，8]。因此,本实验针对淫羊藿苷对增殖平滑肌细胞的促凋亡作用进行了研究。首先通过TUNEL法,利用TdT酶的作用，对凋亡细胞中的片断化DNA的3’-OH游离末端进行高效特异性标记FITC-dUTP，然后使用荧光显微镜直接进行观察，镜下可见多个呈黄绿色荧光的TUNEL阳性细胞，证实了淫羊藿苷的促凋亡作用。为进一步探讨，本实验又通过流式细胞术检测了不同剂量的淫羊藿苷作用下增殖细胞的凋亡率，结果表明随药物浓度的增加，细胞的凋亡率增加。其作用机制尚需进一步探讨。
       由于淫羊藿苷在心血管疾病的治疗方面具有极高的研究和应用价值,本实验通过研究淫羊藿苷对HCY诱导增殖的血管平滑肌细胞生长的影响，为淫羊藿苷治疗新的适应证提供了重要的实验依据。
       【参考文献】
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