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       【摘要】 
       目的探讨临床治疗类风湿性关节炎(RA)使用频率高的解表药、祛风湿药、活血药及其复方对佐剂性关节炎(AA)大鼠的治疗效果、作用机制以及在复方合剂中发挥主要作用的药物。方法造模佐剂性关节炎大鼠，各组给予不同的药物合剂灌胃治疗，观察继发侧足爪肿胀度;22 d后，检测足爪浸液中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、前列腺素(PGE2)水平。结果复方合剂、地塞米松、祛风湿合剂、解表合剂、活血合剂对AA大鼠均有治疗作用。复方合剂、地塞米松、祛风湿合剂作用最强，且它们足爪浸液TNF-α、IL- 1β、PGE2水平都明显低于模型组。结论复方合剂能明显抑制AA大鼠足爪肿胀，祛风湿合剂在复方合剂中可能发挥主要的治疗作用。作用机制可能都是通过抑制炎性因子TNF-α，IL- 1β，PGE2水平表达。
       【关键词】  类风湿性关节炎; 佐剂性关节炎; 配伍规律; 作用机制
       中医对类风湿性关节炎(rheujmatoid arthritis，RA)的治疗积累了丰富的临床经验，但系统性、科学性不足。祛风除湿，活血解表是该类复方常用的配伍规律。为探讨中药治疗RA的配伍规律，我们选取在治疗类风湿性关节炎临床使用频率最高的解表药(麻黄)、祛风湿药(川乌)、活血药(当归)作为研究对象[1]。为增强药物的疗效，我们将上述药物配伍成药对合剂：解表合剂(麻黄-桂枝)、祛风湿合剂(川乌-草乌)、活血合剂(当归-川芎)、复方合剂(上述药物配伍而成)。通过给患有佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)的Wistar大鼠灌胃不同的药对合剂或复方合剂，观察大鼠继发侧足爪肿胀体积、足爪浸液TNF-α、IL-1β、PGE2水平，分析治疗效果、作用机制及发挥主要作用的药对组等。
       1 材料
       1.1 动物与分组健康SPF级Wistar雄性大鼠(合格证号：SCXK鲁20080004)84只，体质量(250±50)g，购自山东大学实验动物中心，饲养1周后，随机数字法分为7组，每组12只，即正常对照组(N)、模型组(M)、地塞米松组(D)、复方组(FF)、祛风湿组(QFS)、解表组(JB)、活血组(HX)。
       1.2 试剂与药物
       1.2.1 试剂卡介苗80 mg/ml(北京生物制品研究所2008040801)，不完全弗氏佐剂(Sigma公司);大鼠TNF-α ELISA试剂盒、大鼠IL-1β ELISA试剂盒、大鼠PGE2 ELISA试剂盒(赛尔斯生物制品公司);自治足爪容积测量仪;Thermo Multiskan MK3酶标仪(北京惠安泽泰科技有限公司)。
       1.2.2 药物及制法中药麻黄、桂枝、制川乌、制草乌、当归、川芎购自莱阳市江波大药房，由山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室鉴定全部合格。醋酸地塞米松片，国药准字H20055075，青岛国风高科技药业股份有限公司产品。
       解表合剂由麻黄与桂枝按1∶1组合，制成生药含量1 g/ml的水煎液;祛风湿合剂由制川乌与制草乌按1∶1组合， 制成生药含量0.35 g/ml的水煎液;活血合剂由当归与川芎按3∶2组合，制成生药含量1.4 g/ml的水煎液;复方合剂由麻黄、桂枝、制川乌、制草乌、当归、川芎按3∶3∶1∶1∶4∶2比例组成，制成生药含量2.7 g/ml的水煎液;以上各组合剂水煎液在本校药剂实验室完成。地塞米松在灌胃前制成浓度为0.125 mg/ml溶液。
       2 方法
       2.1 模型制备参考文献，正常对照组每只大鼠左侧足爪皮内注射生理盐水0.1 ml，其余每组每只大鼠左侧足爪皮内注射卡介苗浓度为10 mg的CFA 0.1 ml，制备佐剂性关节炎大鼠模型[2]。
       2.2 给药方法 AA大鼠从注射CFA当天开始给药，各组大鼠给予不同的药物，给药方法灌胃。药量参按动物的体表面积折算大鼠用量：大鼠药用量(g/kg)=人的药用量×0.018×5。人的药用量参照田代华主编《实用中药辞典》[3]，地塞米松片的用量参考药物说明书。本实验中大鼠药实际投药量5倍于计算所得大鼠用药量。即：大鼠实际用量(g/kg)=大鼠用药量(g/kg)×5，经计算可得，正常组给予灌胃蒸馏水4 ml/d，模型组灌胃等量蒸馏水，地塞米松组灌胃地塞米松悬浊液0.5 mg/ (kg·d)，祛风湿组灌胃川草乌合剂1.4 g/ (kg·d)，活血组灌胃归芎合剂5.6 g/ (kg·d)，解表组灌胃麻桂合剂4.0 g/(kg·d)，复方组灌胃复方合剂10.8 g/(kg·d)。给药时间22 d。
       2.3 指标检测
       2.3.1 足爪肿胀体积的测量用自制的大鼠足爪容积测量仪，于第11天开始隔日测右足爪容积。按下述公式计算足爪肿胀度：S(%)=(BV-AV)/AV×100%。注：S为足爪肿胀度，AV注射佐剂前的容积，BV注射佐剂后的容积。
       2.3.2 右侧后足爪前列腺素(PGE2)、白介素-1，β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的检测[4]大鼠造模的第22天，乙醚麻醉后处死大鼠，在右侧踝关节上0.5 cm处剪下炎性足爪，纵向切开，放入盛有生理盐水5 ml的试管中，4℃浸泡24 h，离心浸泡液，取上清液，放入-20℃冰箱中保存待测。采用酶联免疫吸附(ELISA)法，按试剂说明书的方法，测定右侧足爪浸液TNF-α、IL-1β、PGE2水平。
       2.3.3 统计学处理计量资料以±s表示，各参数的比较使用SAS9.0统计软件中单因素方差分析程序检验各组间差异显著性,组间比较采用dunnett检验。
       3 结果
       3.1 继发侧足爪肿胀体积变化从表1可以看出，与模型组比较，复方组、地塞米松组、祛风湿组、解表组、活血组右侧足爪肿胀度明显缓解，其中复方组、地塞米松组、祛风湿组作用最强(P<0.01)，解表组和活血组次之(P<0.05)。组间比较显示，从治疗后第13天开始，复方组、地塞米松组、祛风湿组的治疗效果基本相同。与复方组比较，祛风湿组、地塞米松组与复方组在治疗效果上无统计学差异(P>0.05)，活血组对足爪肿胀抑制程度弱于复方组(P<0.05)，解表组的抑制作用最弱，且与复方组有显著统计学差异(P<0.01)。
       3.2 造模第22天各组大鼠足爪浸液炎性因子水平的比较
       3.2.1 各组大鼠足爪浸液TNF-α水平的比较从表2看出，模型组AA大鼠足爪浸液TNF-α水平明显高于正常组(P<0.01)，复方组、祛风湿组、地塞米松组TNF-α水平明显低于模型组(P<0.01)，活血组和解表组的TNF-α水平与模型组无明显差异;另一方面，各投药组间，活血组、解表组足爪浸液TNF-α水平显著高于复方组(P<0.01)，祛风湿组、地塞米松组与复方组足爪浸液TNF-α水平无统计学差异(P>0.05)。表1 继发侧足爪肿胀体积的变化
       3.2.2 各组大鼠足爪浸液IL-1β水平的比较从表2看出，模型组AA大鼠足爪浸液IL-1β水平明显高于正常组(P<0.01);复方组、祛风湿组、地塞米松组IL-1β水平明显低于模型组(复方组、祛风湿组P<0.05，地塞米松组P<0.01)活血组和解表组的IL-1β水平与模型组无明显差异;另一方面，各投药组间，祛风湿组、地塞米松组IL-1β水平与复方组无统计学差异(P>0.05)，活血组、解表组与复方组无统计学差异(P>0.05)。表2 继发侧足爪浸液炎症因子水平
       3.2.3 各组大鼠足爪浸液PGE2水平的比较从表2看出，模型组AA大鼠足爪浸液PGE2水平明显高于正常组(P<0.01)，地塞米松组、复方组、祛风湿组PGE2水平明显低于模型组(P<0.01)，解表组PGE2水平明显低于模型组(P<0.05)，活血组PGE2水平与模型组无统计学差异(P>0.05);另一方面，各投药组比较：祛风湿组、地塞米松组PGE2水平与复方组无统计学差异(P>0.05)，活血组PGE2水平明显高于复方组(P<0.05)，解表组PGE2水平与模型组无统计学差异(P>0.05)。解表组PGE2水平明显低于模型组(P<0.05)，活血组PGE2水平与模型组无统计学差异。
       4 讨论
       RA的病因与发病机理尚未完全阐明，但目前公认在RA的发病中，巨噬细胞和成纤维细胞是RA慢性期主要驱动力量，尤其滑膜巨噬细胞合成的IL-1β、TNF-α承担特殊的中心角色。它们刺激滑膜成纤维细胞增生和分泌IL-6、GM-CSF及趋化因子、以及效应分子如基质金属蛋白酶和前列腺素等，并可导致持续性滑膜炎。病人体内的PGE2水平明显升高，其炎症组织中含有大量的PGE2， PGE2可诱导IL-1、IL-6的产生。而且这些细胞因子之间往往相互影响、相互作用，形成网络并互相影响，共同参与RA的发病[5]。
       本次实验中，川草乌合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀都有明显的抑制作用。与复方组治疗效果无差异，同时川草乌合剂能显著抑制足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平;在复方配伍中可能发挥主要的治疗作用。此次实验在一定程度上为临床重用川乌、草乌治疗RA提供了实验依据和支持。
       麻黄桂枝合剂对佐剂性关节炎的右侧足爪肿胀有一定的治疗效果，与复方组比较，效果明显不如复方组;麻黄桂枝合剂对足爪内TNF-α、IL-1β的抑制作用不明显，但对足爪PGE2水平有一定的抑制作用。
       川芎当归合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀有一定的治疗效果，与复方组比较，效果明显不如复方组;活血组大鼠足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平与模型组无差异。
       复方合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀都有明显的抑制作用，与地塞米松组治疗效果无差异，同时复方剂能显著抑制足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平。
       综上所述，复方合剂的效果明显优于活血合剂和解表合剂，与祛风湿合剂无差异，这说明祛风湿药物川乌与草乌在复方中发挥主要的作用，其作用机制是复方合剂能明显抑制足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平表达。
       【参考文献】
         　[1] 周 鲁，宋 航，曾琳琳，等.中药复方治疗类风湿性关节炎的用药规律研究[J].四川中医，2004，22(13)：23.
       
       [2] 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2005：920.
       
       [3] 田代华.实用中药辞典[M].北京：人民卫生出版社，2005：177.
       
       [4] 周 军,方素萍,齐 云，等.桂枝汤对大鼠佐剂性关节炎的防治作用研究[J].中药药理与临床,2000,16(6):1.
       
       [5] Kirkham BW,Lassere MN,Edmonds JP,et al.Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis:a two-year prospective study(the damage study cohort)[J] .Arthritis Rheum，2006,54，54 :1122.