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       【摘要】 
       目的研究灵香草中总黄酮的最佳提取工艺。方法采用正交实验，考察了溶剂浓度、液料比、提取时间、提取次数对灵香草中总黄酮提取量的影响。结果灵香草中总黄酮最佳提取工艺为60%乙醇，液料比10∶1，提取3次，2 h/次。结论该工艺简单易行，是灵香草中提取总黄酮的有效途径。
       【关键词】  灵香草; 总黄酮; 提取工艺; 正交实验
       Study on the Extraction Condition of the Total Flavonoids from Lysimachia foenum - graecum Hance
       YANG Ruiyun, LI Yuan, LIANG Fengqin, LAN Yansu, CHU Limin, GUAN Haibo, YIN Xiaoling
       (Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources, Ministry of Education of China, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)
       Abstract：ObjectiveTo study and optimize the extraction technique of the total flavonoids in Lysimachia foenum - graecum Hance. MethodsOrthogonal test was carried out to investigate the effects of concentration of solvent, the radio liquid to material, time of extraction, and frequency of extraction on extraction results of total flavonoids from Lysimachia foenum - graecum Hance.ResultsThe optimum extraction technique was to extract Lysimachia foenum - graecum Hance in 60% ethanol with the ratio of liquid to material at 10∶1 3 times, with 2 hours for each time. ConclusionThe optimal technique is simple and feasible, and can provide reference for further research of Lysimachia foenum - graecum Hance.
       Key words：Lysimachia foenum - graecum Hance; Total flavonoids; Orthogonal test; Extraction techniques
       灵香草Lysimachia foenum-graecum Hance为报春花科排草属植物[1]，主产于广西、广东、云南等地，有“香中之王”的称号，是一种重要的天然香料来源。同时，灵香草全草入药，味甘，性平，归肺、胃经，具有解表、止痛、行气、驱蛔的功效[2]，极具药用研究价值。本课题组在对灵香草化学成分的研究中，发现其中富含黄酮类成分。黄酮类化合物在自然界分布广泛，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等功效。然而迄今针对灵香草中总黄酮提取工艺的研究尚未见报道。本文通过正交实验优选灵香草中总黄酮的最佳提取工艺条件，为开发和利用灵香草中的黄酮类成分提供理论参考。
       1 材料与仪器
       1.1 材料灵香草2007-07采于广西金秀县，自然风干后，在真空干燥箱中以60℃干燥至恒重，粉碎备用;芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);所用试剂均为分析纯。
       1.2 仪器TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);BS124S型电子天平[赛多利斯(北京)科学有限公司)];R-1001型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);DZF-1B型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
       2 方法与结果[3]
       2.1 总黄酮含量的测定
       2.1.1 芦丁标准溶液的配制精密称取已干燥至恒重的芦丁标准品5 mg，用80%甲醇定容至50 mk容量瓶中，摇匀即配得0.10 mg/ml芦丁标准液。
       2.1.2 测定波长的选择精密量取2.0 ml芦丁工作液于10 ml容量瓶中，加80%甲醇溶液至5 ml，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠溶液1.5 ml，再加80%甲醇定容，放置15 min。以试剂空白做参比，在260～600 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，确定505 nm为最大吸收波长。
       2.1.3 标准曲线的制作和回归方程的建立分别精密量取对照品溶液0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml置于10 ml容量瓶中，各加80%甲醇溶液至5 ml，再加0.3 ml 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠溶液1.5 ml，用80%甲醇溶液定容至10 ml，摇匀，放置15 min后，以空白液作参照，在505 nm波长处测定吸光度。以芦丁浓度(X)和吸光度(Y)绘制标准工作曲线(见图1)，并作最小二法线性回归，得线性回归方程：Y=5.803 8X+0.050 7，相关系数为R2=0.999 4。
       2.1.4 样品液的制备和黄酮含量的测定精密称取 20 g 已干燥至恒重的灵香草样品，按单因素实验和正交实验中不同的提取条件进行回流提取。提取液过滤后减压浓缩，用80%甲醇定容至250 ml，精密吸取样品溶液0.3 ml置10 ml容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，摇匀，冷藏备用。精密量取样品液0.1 ml，按“2.1.3”项操作的方法测定吸光度。由回归方程计算样品总黄酮的含量。
       2.2 单因素实验
       2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取的影响称取灵香草药材6份，每份20 g，分别以10%，30%，50%，70%，80%，95%的乙醇回流提取，用10倍量的液料比第1次提取2 h，第2次提取1 h，合并两次提取液，浓缩得浸膏，按照“2.1.4”项配制样品溶液并测定其吸光度。由回归方程计算出供试样品中总黄酮的含量。不同浓度乙醇对提取的影响如图2所示。实验结果表明，70%乙醇的提取效果较好，往后随着乙醇浓度的加大，黄酮含量反而下降，有可能是随着乙醇浓度的增加，某些脂溶性杂质的溶出的量增加，干扰因素增多。图1 芦丁标准曲线图2 乙醇浓度对总黄酮提取的影响
       2.2.2 液料比对总黄酮提取的影响 称取灵香草药材5份，每份20 g，分别用液料比为8∶1，12∶1，16∶1，20∶1，25∶1的80%乙醇回流提取2 h，过滤，浓缩得浸膏，按照“2.1.4”项配制样品溶液并测定吸光度，计算出样品中总黄酮的含量液料比对提取的影响如图3所示。从图中可知，随着液料比增加，黄酮含量也在不断增大。但当溶剂量大于10倍时，提取率增加缓慢，即灵香草中黄酮类化合物溶出量已趋向最大值。从环境保护和节约溶剂的角度出发，我们选择液料比10∶1左右作为考察对象图3 液料比对灵香草总黄酮提取的影响
       2.2.3 提取时间对总黄酮提取的影响称取灵香草药材5份，每份20 g，用100 ml 80%乙醇回流提取，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，过滤，浓缩得浸膏，按照“2.1.4”项测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。
       提取时间对总黄酮提取的影响如图4所示。结果表明，提取1.5 h后总黄酮总量增长速度有所减缓。考虑到生产工艺对时间的要求，我们选择1.5 h左右的时间作为考察对象。
       2.2.4 提取次数对总黄酮提取的影响 称取灵香草药材5份，每份20 g，用50 ml 80%乙醇回流提取2 h，提取次数分别为1，2，3，4，5次，过滤，浓缩得浸膏，按照“2.1.4”项测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量。提取次数对总黄酮含量的影响如图5所示。结果表明随着提取次数增加，总黄酮的含量也增加。但提取3次后，含量变化曲线已较为平缓。考虑到生产工艺对时间的要求和溶剂量的损耗，提取次数以3次为宜。图4 提取时间对灵香草总黄酮提取的影响图5 提取次数对灵香草总黄酮提取的影响
       2.3 正交实验采用L9(34)正交实验设计，结合单因素实验结果，进一步考察乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)对黄酮含量的影响，以确定最佳提取工艺条件。正交实验因素设计见表1，实验结果见表2，方差分析见表3。从表2可知，在实验范围内影响灵香草总黄酮提取的主次因素为D> A > C>B，即提取次数>乙醇浓度>提取时间>液料比。从表3方差分析可知提取次数和乙醇浓度为显著因素，其它两个为不显著因素。通过综合以上因素，确定最佳提取工艺条件为A1B2C2D3，即60%乙醇、液料比10∶1、2 h/次、提取3次。
       2.4 最佳提取工艺条件的验证按上述最佳提取工艺条件进行3次验证试验。结果见表4。由验证结果可知，按最佳工艺条件得到的总黄酮含量为0.98%，均高于其他各正交实验值，RSD = 0.64%(n=3)，说明此工艺条件稳定、可行。
       2.5 精密度实验精密量取同一测试样品，按照“2.1.4”项测定吸光度，重复测定6次。结果见表5。RSD为0.76%，表明本方法精密度良好。
       2.6 稳定性实验取同一样品，按照“2.1.4”项测定吸光度，每隔5 min测1次吸光度，RSD为1.10%，表明样品溶液在1 h内测定基本稳定。见表6。
       表2 正交设计及数据处理表3 方差分析结果表4 验证试验结果表5 精密度实验结果　表6 稳定性实验结果
       3 讨论
       正交实验结果表明，在乙醇热浸提取灵香草中总黄酮时，各因素对提取量的影响大小次序为：提取次数>乙醇浓度>提取时间>固液比，其中提取次数的影响最大，固液比的影响最小。在选定的水平范围内，随着回流温度和固液比的增大，提取量亦提高，但由于本试验中使用的固液比值较大，提取充分，故对灵香草总黄酮提取量的影响较小。从极差分析中可见，乙醇提取灵香草总黄酮的最佳工艺条件是A1B2C2D3，即60%乙醇，液料比10∶1，2 h/次，提取3次。按此方案提取，所得总黄酮含量最高。该工艺简单易行，稳定性好，是灵香草中提取总黄酮的有效方法。
       【参考文献】
         　[1] 龚复俊，王有为. 广西灵香草挥发油化学成分[J]. 植物资源与环境学报, 2004, 13(3)：59.
       
       [2] 江苏新医学院. 中药大辞典，下册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：2470.
       
       [3] 杨瑞云，何瑞杰，李 远，等. 正交试验法优选广豆根中总黄酮提取工艺[J]. 中药材，2009，32(3)：441.