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       【关键词】  蜗牛多糖；,,提取；,,免疫学活性
       摘要：目的提取蜗牛多糖并研究其免疫学活性。方法用碱提醇沉法从江西巴蜗牛中提取多糖，通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验研究蜗牛多糖的免疫学活性。结果蜗牛多糖显著增强小鼠溶血空斑形成，提高小鼠巨噬细胞吞噬指数，增强小鼠迟发型变态反应，显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率，且有良好的量效关系。结论蜗牛多糖能提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能。
       关键词：蜗牛多糖；  提取；  免疫学活性
       Extraction of Snail Polysaccharides and its Immunologic Study
       ZHAN Xiaodong, WANG Kexia, LI Chaopin, KANG Li
       (School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001,China; Anhui Huainan Chaoyang Hospital, Huainan 232007,China)
       Abstract:ObjectiveTo extract Snail polysaccharides(SP) and study their immunologic activity. MethodsPolysaccharides were extracted from Bradybaena kiangsiensis by alkali method and effects of SP on immunity were investigated by haemolytic plaque assay, macrophage function assay, delayed type hypersensitivity reaction and splenic lymphocyte transformation assay in mice. ResultsSP strikingly increased haemolytic plaque, promoted macrophage function, enhanced delayed type hypersensitivity reaction, and remarkably raised splenic lymphocyte transformation efficiency in a dosedependent manner. ConclusionSP is able to enhance immunity.
       Key words:Snail polysaccharides;   Extraction;    Immunologic Activity
   
　　蜗牛入药在我国历史悠久。公元6世纪陶弘景著《名医别录》和李时珍的《本草纲目》中已有蜗牛药方的详细论载。现代中医认为蜗牛味咸寒，入大肠、肺、肝、肾经，具有清热解毒、化痰消肿、平喘理疝之功效。民间亦有用蜗牛治疗肝炎的偏方。据报道，淡水和海洋贝类多糖具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫的作用［1，2］。由此我们认为陆生贝类蜗牛的以上功用可能与多糖有关。本实验从江西巴蜗牛（Bradybaena kiangsiensis）中提取出多糖，通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验［3］对蜗牛多糖(Snail Polysaccharide,SP）的免疫学活性进行研究。
       　　1  器材与方法
       1.1   材料
       1.1.1  蜗牛多糖（SP）的提取  新鲜江西巴蜗牛清水洗净，取出软组织加入蒸馏水匀浆，离心（4 000 r/min，15 min），弃上清，加入5%的甲醇浸泡过夜，离心(4 000 r/min，15 min)， 弃上清，加入1% NaOH煮沸12 h，过滤除残渣，按滤液:正丁醇体积比1∶2加入正丁醇，反复萃取4次，1%活性炭脱色，加2倍体积的乙醇沉淀过夜，弃上清，Sevage法脱蛋白(氯仿与正丁醇体积比为4∶1反复萃取多次），加2倍体积乙醇沉淀过夜，弃上清，真空干燥，得白色粉末状蜗牛多糖。
       1.1.2  试剂及仪器  RPMI 1640培养基、胎牛血清均为 Gibco产品；植物血凝素 PHA购自 Sigma公司；印度墨汁，德国 Chroma产品；绵羊红细胞 (SRBC)由健康成年绵羊静脉取血；其他试剂均为国产分析纯。CO2培养箱（INCO2L，德国 MEMMERT公司）；显微镜（BX60，日本 Olympus)；紫外分光光度计 (UV-160，日本)等。
       1.1.3  动物  昆明种小鼠，13~15周龄，♀♂各半，质量为（20±2）g。
       1.2  方法
       1.2.1  分组  昆明种小鼠随机分成4组，每组10只。即对照组，SP低、中、高剂量组。SP的 ip剂量分别为50，100，200 mg・kg-1，对照组 ip等量生理盐水 (NS）。
       1.2.2   溶血空斑实验  分组同上，SP连续 ip 10 d,末次给药24 h后每只小鼠  ip 4×108 /ml SRBC 1 ml,将 SRBC免疫4  d的小鼠颈椎脱臼法处死,取脾脏,加入 RPMI 1640液, 制成均匀悬液,通过200目钢丝网，RPMI1640液清洗2次，制成细胞悬液（5×106/ml）。依次将预温至40℃的25% SRBC、经 SRBC吸收的灭活胎牛血清和脾淋巴细胞悬液各0.1 ml加入预热47℃的含0.7%琼脂的华氏管中，迅速混匀，立即倾注于37℃含1.4%琼脂的平皿，37℃孵育1 h。加入1：5稀释的新鲜豚鼠血清0.5 ml，37℃孵育30 min。计算溶血空斑数。
       1.2.3  巨噬细胞吞噬功能实验  分组同上，SP连续 ip 10 d, 末次给药24 h后每只小鼠尾静脉注射印度墨0.2 ml,注射后2，6 min分别从内眦静脉丛取血0.2 ml,加入含2 ml0.1% Na2CO3的小试管内, 600 nm处测OD值，按下式计算吞噬指数 K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)
       1.2.4   迟发型变态反应  分组同上，每只小鼠 ip 10% SRBC 0.5 ml致敏。实验组 ip SP，对照组注射等量NS,连续注射7 d。末次给药后6 h，在小鼠左足垫注射0.1 ml 10% SRBC，右足垫注射等量 NS，24 h后测量左右足垫厚度，计算差值。通过测量小鼠皮肤肿胀程度来反应细胞免疫功能的强弱。
       1. 2. 5    小鼠脾淋巴细胞转化实验  分组同上，SP连续 ip 10 d, 末次给药24 h后颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾脏，加入 RPMI 1640液, 制成均匀悬液，通过200目钢丝网,  RPMI 1640液清洗2次，调成细胞悬液（1×106 /ml）。96孔平板依次加入100 μl 小鼠脾淋巴细胞悬液、100 μl RPMI1640培养液、10%胎牛血清及 PHA 10 μg，37℃，5% CO2孵育48 h，2 000 r/min离心 5 min，瑞氏染色，计数200个脾淋巴细胞，根据形态学指标按下式计算小鼠脾淋巴细胞转化率：淋巴细胞转化率（％）=已转化的淋巴
细胞数/(已转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数)
       1.2.6  数据处理  所有数据均以 ±s表示，组间比较用方差分析，采用 SPSS11.0软件处理。
       　　2   结果
       2.1   溶血空斑实验  溶血空斑是反应机体 B细胞抗体生成多少的指标，抗体生成越多溶血能力越强，形成的空斑数越多。实验结果表明，SP能显著增强小鼠溶血空斑形成(P＜0.01)，对 B细胞免疫有促进作用，且有良好的量效关系。
       2.2  巨噬细胞吞噬功能实验  碳粒廓清是反应机体巨噬细胞吞噬功能的指标。实验结果表明，SP能提高小鼠巨噬细胞吞噬指数(P＜0.05)，即增强小鼠巨噬细胞吞噬功能，且有良好的量效关系。
       2.3    迟发型变态反应  迟发型变态反应是反应机体T细胞对外源性物质敏感性的指标，其值高低代表机体的T细胞免疫能力。实验结果表明，SP能增强小鼠迟发型变态反应(P＜0.05)，即能增强T细胞免疫，且有良好的量效关系。
       2.4   小鼠脾淋巴细胞转化实验  脾淋巴细胞转化实验是反应机体T细胞在非特异性丝裂原的刺激下的反应性，以此了解机体的细胞免疫状态。实验结果表明，SP能显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率(P＜0.01)，即能增强T细胞免疫，且有良好的量效关系。结果见表1。
       表1  蜗牛多糖 (SP)对小鼠免疫功能的影响(略)
       与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
       　　3  讨论
       多糖是广泛存在于有机体内的一种重要的结构成分，也是一种重要的信号或信息分子的受体。它参与分子识别、细胞黏附及防御等生理过程的调节活动。近年来，实验发现它们同时还具有抗肿瘤、抗感染、增加机体免疫、抗衰老、抗放射损伤、降血脂、降血糖等生物活性,并且无毒副作用［4~6］，成为研究热点。其中植物多糖作为免疫调节剂已广泛应用于临床，用作乙肝和肿瘤等的辅助治疗。近年来发现动物多糖，特别是贝类多糖同样具有上述功用［7］，但相关报道较少。我们的研究表明蜗牛多糖能提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能，其可能的机制为多糖作为信号传导分子和细胞间的识别分子参与机体免疫应答，促进机体对外来抗原的识别杀伤，同时还具有“宿主中介”作用，刺激网状内皮系统，提高宿主对特异抗原免疫反应力，从而增强机体免疫能力［8］。这表明动物多糖和植物多糖具有相似的生物学效应，这为开发新药提供了一个新途径。本实验虽然显示蜗牛多糖能增强小鼠机体免疫功能，具有良好的应用前景，但有必要对其进行深入研究，以期应用于临床，而且其确切免疫增强机制仍需进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  崔悦礼, 李开源, 赵翠兰, 等. 河蚌多糖(MPa)对巨噬细胞吞噬能力的影响与抗炎作用［J］.云南大学学报(自然科学版) , 1998,20(3):185.
       ［2］  Woo E R, Kim W S, Kim Y S. Virus-cell fusion inhibitory activity for the polysaccharides from various Korean edible clams［J］.Arch Pharm Res, 2001, 24 (6)： 514
       ［3］   金伯泉. 细胞和分子免疫学实验技术［M］. 西安: 第四军医大学出版社, 2002: 90
       ［4］  Kodama N, Harada N. A polysaccharide,extract from Grifola frondosa,inducesTh-1 dominant responses in carcinoma bearing BALB/c mice［J］.Jpn J Pharmacol, 2002,90(4):357.
       ［5］  OOI V, LIU F. immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes［J］.Curr Med Chem, 2000,7(7):715.
       ［6］  Bae JS, Jang KH, Yim H, et al. Polysaccharides isolated from Phellinus gilvus inhibit melanoma growth in mice［J］.Cancer Lett, 2005,218(1):43.
       ［7］  姚  滢, 魏江洲, 王  俊, 等. 厚壳贻贝多糖的提取和免疫学活性研究［J］.第二军医大学学报, 2005,26(8):896.
       ［8］  张  群, 雷林生, 吴曙光. 多糖类药物作用的受体及信号转导机制的研究进展［J］.中草药, 2005,36(4):614.
       (安徽理工大学医学院, 安徽 淮南   232001；安徽淮南朝阳医院，安徽 淮南   232007)