文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究蒺藜总黄酮最佳提取工艺条件。方法采用正交实验，以提取物中总黄酮的含量作为考察指标，优选出最佳提取工艺。结果蒺藜总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取时间1.5 h，提取温度70～75℃，乙醇浓度70%，料液比1∶15(g/ml)，按照最佳提取工艺条件提取蒺藜全草中的总黄酮，含量可达7.152 mg/g。结论实验设计的4因素中，提取时间对结果有极显著的影响，提取温度对结果有显著的影响，乙醇浓度和料液比对结果影响不显著。
       【关键词】  正交实验; 蒺藜; 总黄酮; 紫外分光光度法
       蒺藜Tribulus terrestrisl L.为蒺藜科(Zypophyllaceae) 一年生草本植物，广布全国,习称硬蒺藜。蒺藜全草含有皂苷类、黄酮类、氨基酸类及糖类等成分[1,2]，在心血管系统及强壮、抗衰老、增强性功能等方面表现较强的活性[3～5]。研究发现蒺藜中黄酮类的含量是皂苷含量的1.5倍左右，所含黄酮类化合物的苷元主要为槲皮素(Quercetin)、山萘酚(Kaempferol)及异鼠李素(Isorhamnetin)，且以槲皮素为母核的黄酮类成分含量最高[6]。蒺藜总黄酮提取工艺的研究尚未报道。本研究采用正交实验设计，对影响蒺藜总黄酮提取的因素进行了研究，为获得其最佳提取工艺条件提供实验依据。
       1 材料与仪器
       1.1 供试植物蒺藜植物材料于200607采自宁夏盐池县，由宁夏大学生命学院植物教研室陈彦云教授鉴定为蒺藜科蒺藜属蒺藜Tribulus terrestrisl L.。样品采集后自然条件下阴干，用万能粉碎机粉碎后过40目筛,储存于阴暗、干燥处。
       1.2 试剂芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等试剂均为分析纯。
       1.3 仪器TU-1810DSPC型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、旋转蒸发仪(Buchi，瑞士)、SHZ-D循环水式真空泵(河南郑州长城科工贸有限公司)、电热恒温水浴锅HH.S11-2(北京长安科学仪器厂)。
       2 方法
       2.1 样品提取精密称取蒺藜粉末2 g，共计9份，参照文献[7,8]，采用L9(34)正交设计(见表3～4)回流提取，固定提取次数为3次，抽滤，合并3次滤液，减压蒸馏，回收乙醇，将提取液用无水乙醇定容于100 ml容量瓶中，摇匀，作为待测原溶液。各取上述待测原溶液5 ml，精密测定，置25 ml容量瓶中，加适量无水乙醇超声溶解，稀释至刻度，摇匀，静置。取上清液5.0 ml置蒸发皿中，加入2.0 g聚酰胺粉吸附，于50℃水浴中挥去乙醇，然后转入层析柱，先用25 ml石油醚洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液(至盐酸-镁粉反应为阴性)，置25 ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，作为待测样品溶液。
       2.2 标准曲线的绘制精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg，用无水乙醇溶解，定容至100 ml，得浓度为50 μg/ml的标准液。分别精密吸取上述芦丁标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于10 ml容量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.3 ml，放置6 min，再加10%硝酸铝0.3 ml，放置6 min，加4%氢氧化钠4 ml，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min后，在分光光度计上于510 nm处测定其吸光度，无水乙醇为空白参比。以吸收度A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行回归分析，绘制回归曲线。结果在0～5 μg/ml的范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系。得出回归方程：A=0.064 9C+0.001 2(C:μg/ml)，r=0.999 8。
       2.3 样品总黄酮含量测定精密吸取上述待测样品溶液1.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，按照“2.1.2”项下的方法，在510 nm下测定其吸光度A，按回归方程计算出提取物中的总黄酮含量。
       2.4 方法学考察
       2.4.1 精密度考察精确称取样品粉末约2 g，按照待测样品制备方法制备待测样品溶液，准确吸取待测溶液1.0 ml,置于10 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至10 ml，按“2.1.2”项下的方法，在510 nm下测定其吸光度A，5次测定的平均吸光度为0.061 3，RSD为0.67%，说明仪器的精密度良好。
       2.4.2 稳定性研究将上述溶液每隔10 min测定1次吸光度，5次测定的平均吸光度为0.066 2，RSD为1.21%(n=5)，表明待测样品溶液在1 h内稳定。
       2.4.3 重复性考察将上述溶液平行制备5份待测溶液，测定其吸光度，5次测定的总黄酮得率平均为6.3 mg/g，RSD为0.912%，说明方法的重复性好。
       2.4.4 加样回收率实验分别精密吸取一定量的待测样品溶液，按照上述方法测定其吸光度，计算回收率，平均回收率为100.73%，RSD为1.35%(见表1)，表明方法的回收率较好表1 加样回收率实验已知样品量m/g加入对照品量m/g测定量m/g回收率(%)平均回收率(%)
       3 结果
       3.1 总黄酮提取方法的选择浸泡法：取蒺藜粉末2 g，用15倍量的80%乙醇浸泡3次，2 h/次，抽滤，合并滤液回流法：取蒺藜粉末2 g，用15倍量的80%乙醇提取3次，2 h/次，抽滤，合并滤液。用以上两种提取方法提取蒺藜总黄酮，依次测定其中总黄酮含量，得出回流法提取总黄酮的含量最高为6.612 mg/g，其次是浸泡法为5.263 mg/g。故选用回流法作为蒺藜总黄酮的提取方法，并通过下面正交实验选择最佳提取条件。
       3.2 总黄酮提取的正交实验在选择回流作为提取方法的基础上，拟定乙醇浓度、乙醇用量、提取温度、提取时间作为考察因素，每个因素取3个水平，固定提取次数为3次，选用L9(34)正交表进行实验。因素水平见表2，以提取物中总黄酮的得率为考察指标。结果见表3　对于总黄酮的提取，通过直观分析，B因素影响不显著，故以B因素作为误差进行方差分析。结果见表4。根据表2和表3可以看出料液比、乙醇浓度对指标影响不显著，提取温度对指标有显著性影响(P<0.05)，提取时间对指标有极显著的影响　　3.3 最佳提取条件的验证按照上述确定的最佳条件，做5次平行实验，得出总黄酮的含量比正交实验中的任何一次实验的含量都高，平均为7.152 mg/g，RSD为0.646%。这就进一步说明了正交实验所得到的上述最佳条件为蒺藜总黄酮提取的较为理想的工艺表2 因素水平　表3 L9(34)正交实验设计以及结果表4 方差分析
       4 讨论
       基于回流提取方法，设计了较为合理的4因素3水平的正交实验，选用了4种因素，研究对蒺藜中总黄酮提取的影响，实验结果表明回流提取技术与传统的浸泡相比较具有提取时间短、总黄酮得率高等优点。根据实验结果，最终确定提取工艺如下：取粉碎的蒺藜粉末适量，提取时间为1.5 h,乙醇浓度为70%,提取温度为70～75℃,料液比为1∶15(g/ml)。
       本研究选用正交实验法优化实验条件，大大提高了蒺藜中总黄酮的提取效率。为蒺藜中黄酮类化合物的深入研究和为蒺藜药用成分的进一步开发利用提供依据。
       【参考文献】
         　　[1] 蔡利锋，景凤英，张建国，等.蒺藜化学成分的研究[J].药学学报，1999, 34(10): 759.
       
       [2] Dragomir Dinchev ,Bogdan Janda ,Liuba Evstatieva, et al. Distribution of steroidal saponins in Tribulus terrestris from diferent geographical regions[J].Phytochemistry, 2008, 69: 176.
       
       [3] Oludotun A.Phillips ,Koyippalli T. Mathew, Mabayoje A.Oriowo. Antihypertensive and vasodilator effects of methanolic and aqueous extracts of Tribulus terrestris in rats[J].Journal of Ethnopharmacology , 2006,104: 351.
       
       [4] 吴恩融，冯 建，立北龄，等.蒺藜皂甙抗衰老作用的实验研究[J].中国药学杂志，2000,35(2): 49.
       
       [5] 张秀琴，徐 举，金春花，等.蒺藜茎叶总皂甙的强壮作用[J].中成药研究, 1987,17(9): 45.
       
       [6] 师 勤，余伯阳，徐珞珊，等.反高效液相色谱法测定蒺藜类3种水解黄酮甙元的含量[J].药物分析杂志，1999, 19(2): 75.
       
       [7] 吴琼诗.蒺藜全草中总黄酮的含量测定[J].广东药学院学报，1998, 14(4): 273.
       
       [8] 孙敏耀，唐文照，卢 霞，等.分光光度法测定不同采收时间桑叶中总黄酮[J].中草药, 2004, 35 (10): 1098.