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       【关键词】  硒酵母；,,亚硒酸钠；,,抗癌；,,宫颈癌；,,肝癌
       摘要：目的研究不同浓度硒酵母对肿瘤细胞的抑制作用。方法体外培养宫颈癌细胞，经不同浓度的硒酵母处理，MTT法测定硒酵母对肿瘤细胞的抑制作用。小鼠体内接种腹水型肝癌细胞 H22，观察硒酵母体内抗肿瘤作用。测量小鼠体重变化，CD4+，CD8+含量，白蛋白、总蛋白含量。结果含硒5 μg/ml的硒酵母即能显著抑制荷癌小鼠腹水生成，提高 CD4+，CD8+比值，升高血清白蛋白及总蛋白含量（P＜0.01）。结论硒酵母具有良好的抗肿瘤作用，其作用优于同剂量的亚硒酸钠。
       关键词：硒酵母；  亚硒酸钠；  抗癌；  宫颈癌；  肝癌
       Anticancer Activity of Selenium Yeast
       WANG Junzhi, ZOU Kun, XIAO Lingling, YAO Juan
       (Three Gorges University, Hubei Provincial Key Laboratory for Natural Product Research and Utilization, Yichang 443002，China；Hubei Angel Yeast Co. Ltd, Yichang 443003,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the anticancer activity of different density selenium yeast.MethodsCultured cancer cells of cervix in vitro,treated by different density selenium yeast,used the way of MTT to determine the activity of inhibition against the tumour cell.. Inoculated hepatoma cell H22 to mouse abdominal cavity ,observed the anticancer activity of selenium yeast in vivo.Measured the changes of body weight ,content of CD4+，CD8+,protein level of albumin and total protein .ResultsThe experiment showed that selenium yeast(containing selenium 5μg/ml) significant inhibited the formation of cervix cancer in vitro(P＜0.05),selenium yeast (containing selenium 15 μg/ml) decreased abdominal dropsy ,heightened the ratio of CD4+/CD8+,increased protein level of albumin and total protein(P＜0.01).ConclusionSelenium yeast have favourable anticancer activity.It is better than Sodium selenite with the same dose.
       Key words:Selenium yeast;  Sodium selenite;  Anticancer;  Cancer of the cervix;  Hepatoma
   
　　硒是人体必需的微量元素，参与合成人体内多种含硒酶和含硒蛋白，对细胞的生长、繁殖和生理功能起着重要的作用。我国的微量元素硒营养剂目前主要以无机盐形式为主。以无机盐形式作为硒源补充微量元素硒，不利于人体的吸收和利用，且具有一定的毒副作用，而有机硒由于便于机体吸收利用，具有生物活性较高、毒性低等特点，成为补充微量元素硒的新途径。近年来国内学者在探索富硒食品和中药防治各种疾病方面获取了许多新进展，硒酵母便是一种很有发展前途的新型硒营养剂。硒酵母是酵母在适量硒元素条件下，经发酵、生长后生成的酵母菌。鲜活的酵母细胞在生长过程中吸收硒元素，经生化反应转化为 L（+）硒代蛋氨酸的结合形态［1］。硒酵母作为一种新型的有机硒产品，生物利用率高、毒性低，能有效地提高血硒水平，可作为一种添加剂添加到食品中以增补硒含量。硒酵母在生产功能性食品如抗癌食品或抗衰老食品等方面有很高的应用价值［2］。美国、法国、荷兰等国家已用硒酵母作为硒补充药品。近年来，硒的抑癌作用日益受到人们的重视和广泛研究。为评价硒酵母抗癌活性，本文对硒酵母和亚硒酸钠的抗癌活性进行了比较。
       　　1  器材
       1.1  药品硒酵母（湖北安琪酵母股份有限公司提供）、亚硒酸钠（广州化学试剂厂）、PRMI1640培养（Gibco）、胰蛋白酶（American Biotel）、小牛血清（上海华美生物工程公司）、丝裂霉素 C（日本协和发酵工业株式会社）、蛋白试测定剂盒（上海科华-东菱诊断用品有限公司生产的 TP、ALB试剂盒）。
       1.2  动物KM小鼠，雌雄各半，18~22 g，SD大鼠，雌雄各半，180~250 g华中科技大学同济医学部实验动物中心提供。小鼠合格证号：19-052，大鼠合格证号：19-020。
       1.3  细胞宫颈癌细胞，小鼠腹水型肝癌细胞H22，由三峡大学免疫教研室提供。
       1.4  仪器CO2培养箱（日本三洋公司）、分析天平（上海第二天平制造厂）、UV-2100分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］、酶标仪（芬兰 Labsystem Multiskan MK3）、流式细胞仪（BeckMan）。
       　　2  方法与结果
       2.1  硒酵母中硒含量的测定［3］分别取含硒0.2  μg/ml的亚硒酸标准液0，1，2，3，4，5 ml于比色管中，加入 EDTA 1 ml，HCl-KCl缓冲液2 ml，氯酸钾2 ml，变色酸2 ml，盐酸苯肼1 ml，加水至15 ml，摇匀，在沸水浴中加热20 min，于冷水中冷却后，用1 cm比色皿于510 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。测出标准曲线为：Y=8.294 2 X+0.014 8，r=0.999 1。称取硒酵母样品0.2 g于锥形瓶中，加10 ml混合酸及玻璃珠加热消化。当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2 ml左右，定容至50 ml容量瓶中。从容量瓶中取出0.2 ml消化液，将其按照测定标准曲线的方法测定，得到硒酵母中总硒含量为1 608.75 ppm。
       2.2  血药浓度测定分别以硒含量相同的无机硒与硒酵母给大鼠灌胃，给予硒的剂量为0.03 mg/kg，给药后1 h取大鼠血清，利用硒酵母中硒含量的测定方法，测定硒含量。同一标准曲线测定血清中硒的含量。给予无机硒的大鼠血清硒含量为42.0 μg/ml；给予硒酵母大鼠血清的硒含量约为50.6 μg/ml，血药浓度高于无机硒浓度20%。
       2.3  对宫颈癌细胞生长的影响［4］硒酵母经双蒸水超声提取3次，提取液测定硒含量备用。各受试药水溶液，用灭过菌的0.22 μl微孔过滤器除菌备用，同时测定硒含量。取96孔细胞培养板，每孔中加100 μl含105处于对数生长期的宫颈癌细胞的培养液（含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液），每孔加入40 μl的含硒样品，使硒的终浓度分别为5 μg/ml，10 μg/ml，15 μg/ml，每一剂量各设6个复孔，以未加药的细胞作为空白对照组。置 CO2培养箱中培养3 d。3 d后离心10 min，弃上清后，每孔加入 MTT 20 μl，37℃培养箱中培养4 h，再离心弃上清后每孔加二甲亚砜200 μl，微量振荡器振荡5 min，用酶标仪比色（波长595 nm），测定吸光度（A）值，以吸光度值反应活细胞数量。结果见表1。
 
　　结果表明：无机硒3个剂量组、硒酵母低、中剂量组对宫颈癌细胞生长具有显著抑制作用。
       2.4  对小鼠腹水型肝癌细胞H22的影响
       2.4.1  对荷瘤小鼠体重的影响小鼠腹水型肝癌细胞H22体内传代两次，从荷腹水型肝癌细胞H22的小鼠中抽取含有H22细胞的腹水液，置离心管内，离心（1 000 r/min，10 min），弃上清液，PBS（0.15 mol/L，pH 7.2）漂洗3次，细胞计数，调整细胞浓度为107个/ml，分别注入小鼠腹腔，0.2 ml/只。次日，将小鼠随机分为6组，每组10只，灌胃给药1次/d，连续10 d，阳性对照组腹腔注射丝裂霉素。注入腹水型肝癌细胞 H22前对小鼠进行第1次体重称量，四天后每两天测1次体重，计算与第1次体重的差异，以体重差异反应腹水生成量。结果见表2。结果表明：无机硒、硒酵母均显著抑制荷瘤小鼠体重增长，减少腹水生成，硒酵母较无机硒作用时间持久。造模10 d后，小鼠腹水增加迅速，药物的抑制作用不明显。
       表1  硒对宫颈癌细胞生长的影响(略)
       与空白对照组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=6
       表2  硒对荷瘤小鼠体重的影响(略)
       与模型组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=8
       2.4.2  对荷瘤小鼠 CD8+和CD4+的含量影响［5］于造模第10天，末次给药30 min后摘除眼球取血，肝素抗凝。取血20 μl加入抗凝管中，分别加入8 F和4 P两种试剂10 μl，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加入1 mlPBS，振荡，离心，弃清液，再加入0.5 mlPBS，振荡，离心，弃清液，再加入0.5 ml PBS，振荡，流式细胞仪检测 CD8+和CD4+的含量。结果见表3。
       表3  硒对荷瘤小鼠血样中 CD4+与CD8+的含量的影响(略)
       与模型组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=8
       2.4.3  对荷瘤小鼠血清蛋白的影响于造模第10天，末次给药30 min后摘除眼球取血，分离血清，用试剂盒规定的方法测定白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）含量。结果见表4。
       表4  硒对ALB与TP含量的影响(略)
       与模型组比较,*P＜0.05，**P＜0.01，n=8
 
　　结果表明：无机硒、硒酵母均能显著提高腹水型肝癌血清白蛋白、总蛋白含量。
       　　3  讨论
       本研究通过体外、体内不同模型，研究了硒酵母对宫颈癌、肝癌的抗癌作用，并与亚硒酸钠进行了比较。实验表明的硒酵母对受试癌细胞生长具有良好的抑制作用，其体内抗癌作用明显优于同剂量亚硒酸钠。体外抗癌实验由于硒酵母提取液为黄色，对比色影响较大，同时，硒酵母提取液中还含有蛋白质、糖类等多种物质，对细胞生长产生不同影响。因此，硒酵母与亚硒酸钠体外抗癌活性的比较，还需要进一步纯化硒代蛋白，消除干扰因素，再进行实验。硒酵母通过抑瘤、调节机体免疫功能等途径能起到预癌、抗癌作用。肿瘤免疫以细胞免疫为主，T细胞是最主要的肿瘤免疫细胞之一。CD4+T细胞主要分泌细胞因子来调节抗肿瘤免疫，CD8+T细胞主要分泌抑制性 T细胞因子发挥特异性免疫抑制作用，因此测定 CD4+，CD8+及 CD4+，CD8+比值可在一定程度上反映机体免疫功能。硒酵母主要是通过提高 CD4+含量，升高  CD4+/CD8+比值，改善细胞免疫功能。硒酵母较无机硒易于吸收、血药浓度高、作用时间长。同时，同剂量（0.1 mg/kg）的硒酵母与亚硒酸钠喂养小鼠，硒酵母组生长良好，皮毛顺滑，活动自如，亚硒酸钠组则出现一定毒副反应，表现为竖毛，生长缓慢，少食懒动。显示硒酵母毒性低。硒酵母作为一种新型补硒制品，具备有多种优势，具有广阔的市场前景和较高的经济效益。
       　　参考文献：
       ［1］  Media.D,Morrison DG.Gurrent ideas on selenium as a chemopreventive agent［J］.Immuno Pathol Res ,1998,7:187.
       ［2］  李爱芬，刘振乾，徐  宁，等.微量元素硒载体酵母发酵的研究［J］.暨南大学学报（自然科学版），2004，25（5）：626.
       ［3］  贺立东.分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量［J］.食品工业科技，2000，21（5）：76.
       ［4］  王瑞雪，骆云鹏，韦  克，等.MTT法用于抗癌药物筛选的实验研究［J］.重庆医科大学学报. 1991，16（4）：330.
       ［5］  邹玉红，叶  欣，杨宪勇.高强度聚集超声热疗法对原发性肝癌患者 T淋巴细胞亚群和 NK细胞的影响［J］.中国临床康复，2005，9（2）：168.
       (三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌  443002；湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌  443003)