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       【关键词】  悦肝胶囊；,,肝损伤；,,大鼠；,,肝细胞
       摘要：目的探讨悦肝胶囊对四氯化碳（CCl4）损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用。方法以CCl4诱导大鼠肝细胞损伤模型，观察悦肝胶囊对肝细胞的琥珀酸脱氢酶（SDH）、酸性磷酸酶（ACPase）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）活性和糖原含量以及肝细胞形态结构的影响。结果悦肝胶囊能显著提高SDH、G6Pase活性及糖原含量，抑制ACPase活性，并可显著改善受损肝细胞的形态结构变化。结论 悦肝胶囊对CCl4损伤原代培养大鼠肝细胞具有保护作用。
       关键词：悦肝胶囊；  肝损伤；  大鼠；  肝细胞
       Protective Effects of Yuegan Capsule on CCl4induced Injury of Primary Cultured Rat Hepatocytes
       CAI  Yinglan， JIN Zheng， PIAO Lihua， LI Xiangwu， JIN Meishan
       (Department of Hunan Anatomy and Histology and Embryology, College of Basic Medicine,  Yanbian University Yanji 133000, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Yuegan Capsule on CCl4intoxicated primary cultured rat hepatocytes.MethodsHepatocytes injury models were induced by CCl4 in rats in vitro, and treated with Yuegan capsule.Structure of rat hepatocytes and effect of SDH、ACPase、G6Pase activeties and amount of hepatic glycogen were observed. ResultsThe Yuegan Capsule increased the activity of SDH, G6Pase and the amount of hepatic glycogen, and restrain the activity of ACPase, and could improve the changes of rat hepatocytes structure.ConclusionYuegan capsule has protective effects on CCl4induced injury of primary cultured rat hepatocytes.
       Key words：Yuegan Capsules;   Liver failure;   Rats;   Hepatocytes
   
　　悦肝胶囊主要由葛根、丹参、西洋参、麦冬等中药组成，是吉林省延边中医院肝病科以“活血化瘀、通络养肝”为基本治则而研制的复方中药制剂，具有利胆退黄及保肝解毒作用［1，2］。原代培养肝细胞已用于多方面的研究，其灵敏度高、参差性小、再现性好。本实验以CCl4诱导大鼠肝细胞损伤模型，观察悦肝胶囊对CCl4损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用，并进一步探讨了其机理。
       　　1  材料
       1.1  动物  Wistar系大鼠（乳鼠）由延边大学医学部资产与实验管理办公室实验动物科提供。
       1.2  药品与试剂悦肝胶囊：延边大学医学部药学院天然药物教研室分离、提取（葛根30 g，丹参30 g，麦冬20 g，西洋参20 g，加蒸馏水煮1 h后过滤，滤出液备用，把原药再煮沸1 h后过滤，混合2次滤液浓缩成100 ml）；CCl4：北京化学试剂厂产品；东宝肝泰片：中国通化东宝药业股份有限公司产品；新生小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品；RPMI1640培养基：GIBCO公司产品；胰蛋白酶：DIFCO公司产品；胶原酶：SIGMA化学公司产品。
       1.3  仪器  SC35型倒置显微镜：日本OLYMPUS产品；VANOX型万能显微镜：日本OLYMPUS产品；S3500N型扫描电镜：日本HITACHI公司产品；TD2000型图像分析仪：北京天地百年科技有限责任公司产品。
       　　2  方法
       2.1  原代单层乳鼠肝细胞培养方法采用姜玉顺等［3］建立的方法培养至3~4 d后用于实验。
       2.2  CCl4诱发培养肝细胞损伤病理模型的制备   用RPMI1640培养液配成3，5，7 mol/L浓度经筛选，选用5 mol/L浓度为本实验可逆性肝细胞损伤模型。
       2.3  分组培养大鼠肝细胞3~4 d，取生长良好的培养瓶40瓶分为4组。正常对照组每隔3天更换培养基；模型对照组加入5 mol/L  CCl4 ；药物对照组加入 5 mol/L CCl4 +0.24 mg/L 东宝肝泰；实验组加入5 mol/L CCl4+ 1.5 mg/L悦肝胶囊。作用24 h后，模型对照组换接种培养基；药物对照组换加有0.24 mg/L东宝肝泰的培养基；实验组换加有1.5 mg/L悦肝胶囊的培养基继续培养。
       2.4  细胞化学观察取生长盖玻片，显示SDH、ACPase、G6Pase和糖原。SDH显示采用亚铁氰化甲法；ACPase显示采用Gomori法；G6Pase显示采用Wachstein法；糖原显示采用PAS反应。染色后用日本OLYMPUS万能显微镜观察拍片并利用病理显微分析系统进行定量分析（每组随机选5张盖玻片，每张盖玻片再随机选3个视野，测定每个视野颗粒面积百分比）。
       2.5  扫描电镜观察 取生长良好的培养瓶，弃去培养液，经PBS冲洗，4%戊二醛固定4 h，然后再冲洗3次，2%锇酸液固定3 h，常规冲洗、脱水、乙酸异戊酯置换、HCP2临界点干燥、离子溅射镀金膜，扫描电镜观察。
       2.6  数据处理应用SPSS10.0统计软件进行方差分析。
       　　3  结果
       3.1  细胞化学观察SDH：模型对照组SDH反应颗粒比正常对照组明显减少，染色浅；实验组SDH活性明显增强、染色深。ACPase：与正常对照组相比，模型对照组ACPase活性明显增强，而实验组则有所下降。G6Pase：模型对照组G6Pase反应颗粒比正常对照组明显减少，染色浅；实验组G6Pase活性明显增强、染色深。糖原：与正常对照组相比，模型对照组糖原含量减少，实验组糖原含量接近正常。结果见表1。
       表1   各组乳鼠肝细胞细胞化学染色酶颗粒定量分析结果（略）
       与模型对照组比较，*P<0.001；与正常对照组比较，#P >0.05
       3.2  扫描电镜观察 正常对照组原代培养大鼠肝细胞表面微绒毛密集，细长，有分枝并相互交织。模型对照组微绒毛明显矮小、稀疏，细胞存活率降低。实验组肝细胞表面微绒毛与模型对照组相比明显增多、变高，接近正常对照组，而且细胞存活率也明显高于模型对照组。
       　　4  讨论
       一般认为，CCl4进入机体后，被肝脏细胞色素P450激活，经肝微粒体NADPH依赖的电子传递系统代谢为三氯甲基自由基（・CCl3）和三氯甲基过氧自由基（・ OOCCl3），这两种自由基可掺入到微粒体膜的磷脂部分，启动脂质过氧化，引起肝细胞的各种变化导致肝损伤［4］。SDH位于线粒体内膜与呼吸链形成复合体，由于过氧化脂质的损伤作用，引起上述复合体的改变或破坏，进而使SDH活性下降，由于CCl4作用产生的过氧化脂质及脂质过氧化物与蛋白质分离产生溶酶体，因此，溶酶体数目增加，溶酶体的标志酶ACPase活性增强。CCl4引起线粒体结构的不完整和破坏，自然影响有氧代谢合成ATP的主要供给途径，此时，肝细胞不得不大量分解糖原进行无氧代谢合成ATP，导致糖原减少，而悦肝胶囊能明显改善上述改变。我们的前期实验也表明悦肝胶囊在体内对酒精中毒小鼠肝细胞具有抗脂质过氧化作用［5］。G6Pase是内质网功能标志酶，催化糖原分解为葡萄糖，是糖代谢关键酶，同时也是一种多功能酶，其活性高低与内质网蛋白质合成中的糖基化过程有关，反映细胞蛋白质合成与分泌能力。SDH与G6Pase都是与能量代谢相关的酶，共同反映细胞有氧代谢及能量供应状况［6］。而研究表明，线粒体和内质网的作用不再限于能量代谢与蛋白质合成，它们还参与调节胞质游离Ca2+浓度，其对Ca2+“封闭”作用的丧失是导致细胞损伤、死亡的重要原因 ［7］。本实验用CCl4损伤培养大鼠肝细胞后，G6Pase活性明显降低，而悦肝胶囊能使G6Pase活性增强,表明悦肝胶囊能减轻对内质网的损伤。扫描电镜观察到受损肝细胞表面的微绒毛明显稀疏矮小，这种形态学改变说明肝细胞膜系统已受到损害，提示CCl4代谢产物能通过脂质过氧化作用损伤膜结构的完整性，导致细胞膜通透性增强，而实验组肝细胞表面微绒毛与模型对照组相比明显增多、变高，表明肝细胞膜损伤减轻，说明悦肝胶囊对肝细胞膜系统具有很强的保护作用。总之，本实验结果证明，悦肝胶囊对CCl4损伤肝细胞具有保护作用，其机理可能阻止脂质过氧化，以保护肝细胞的膜性结构不被破坏，阻止了内质网和线粒体的损伤。
       　　参考文献：
       ［1］  李延昌，孙玉凤，冯志杰，等. 赤芍抗肝纤维化的研究［J］.中国中西医结合杂志，2003，10（10）：767.
       ［2］  何冬宁，徐锡坤，许媚华，等. 牡蛎提取营养液对大剂量CCl4小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中国公共卫生杂志，1997，16（3）：152.
       ［3］  姜玉顺，金美善，吴耕书.乳鼠肝细胞的体外培养及组织化学观察［J］.延边医学院学报，1988，11（4）：253.
       ［4］  Plas GL. Chlorinated methanol and liver injury:highlights of the past 50 years［M］.Annu Rey pharmacol Toxicol.2000：4042.
       ［5］  金  政，朴丽花，李相伍，等. 悦肝胶囊对酒精中毒小鼠肝脏保护作用的实验研究［J］.山东中医杂志，2004，23（9）：551.
       ［6］  辜  清，白晓春，胡泗才，等.饲喂泰和乌骨鸡及其黑素对小鼠肝、肠、肾酶组织化学活性的影响［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2000，9（1）：89.
       ［7］  李定国，陆汉明，陈颖伟. 汉防已甲素抗肝纤维化研究进展［J］.世界华人消化杂志，1999，7（2）：171.

　　基本项目：吉林省延边朝鲜族自治州科技攻关资助项目（No.200206）
       (延边大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研部，吉林 延吉   133000）