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       【摘要】 
       目的研制格拉司琼原位凝胶注射剂并考察其体内释药行为。方法以PLGA RG503H(乳酸-羟基乙酸共聚物)为辅料，NMP(N-甲基吡咯烷酮)为有机溶剂制备原位凝胶，皮下注射给药，并采用局部残留量法间接测定其在大鼠体内的累积释放率。结果格拉司琼原位凝胶注射剂1.5 h后有突释效应，释放率达17.1%，7 d后累积释放率为97.27%，基本释放完全。结论格拉司琼原位凝胶注射剂有显著的缓释效果，可进一步研究开发。
       【关键词】  格拉司琼; 原位凝胶; 注射剂; 体内释放
       格拉司琼(Granisetron)是一种强效高选择性的5-HT3受体抑制剂，临床上用于预防和治疗放化疗引起的恶心和呕吐，效果良好[1，2]。目前，国内已有其注射液，片剂和胶囊上市并应用于临床，但未见其原位凝胶给药系统的研究报道。20080915日， 苏格兰ProStrakan制药公司宣布FDA批准第一个经皮吸收的5-HT3受体抑制剂Sancuso上市，Sancuso通过一种粘着剂固定于上臂皮肤，缓慢持续释放止吐药物成分格拉司琼( Granisetron) ，可保持有效血药浓度长达5 d。为克服以往剂型的不足，达到缓释效果，笔者根据格拉司琼的理化性质和原位凝胶的特点，设计了格拉司琼原位凝胶注射剂，并对其在大鼠体内的释放作了初步研究。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器Agilent 1100 HPLC仪(美国安捷伦公司);电子天平(梅特勒公司)，XW-80C 旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，匀浆器(上海氟鲁克流体机械制造有限公司)，TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)。
       1.2 试药格拉司琼(北京益康思达医药科技有限公司，批号：090118);PLGA RG503H(乳酸-羟基乙酸共聚物)(德国Boehringer Ingelheim公司);NMP(N-甲基吡咯烷酮)(Sigma公司);甲醇(中国医药集团化学试剂有限公司);丙酮(中国医药集团化学试剂有限公司);流动相为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
       1.3 动物雌性SD大鼠,体质量(200±10)g(上海中医药大学动物实验中心提供)。
       2 方法与结果
       2.1 原位凝胶注射剂的制备将处方量的格拉司琼原料药溶于NMP中，不断搅拌至完全溶解，加入处方量RG 503H，搅拌混匀，室温条件下过夜，使凝胶充分溶胀分散均匀得到澄明的溶液，即得格拉司琼原位凝胶。用1 ml无菌注射器吸取适量凝胶，排出气泡，封装待用。
       2.2 局部残留量测定方法的建立
       2.2.1 波长选择精密称取格拉司琼原料药适量，加二氯甲烷配制成50 μg/ml的溶液，以二氯甲烷为空白，照《中国药典》(Ⅱ部)2005年版附录ⅣA项下紫外-可见分光光度法，于200～400 nm波长下扫描，结果显示在302 nm处有最大吸收。取适量空白凝胶溶于二氯甲烷中，同法扫描，结果在302 nm处无吸收。故确定302 nm为检测波长。
       2.2.2 色谱条件[3,4]及系统适用性实验色谱柱：Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(含0.28%三乙胺，冰醋酸调节pH=6)-甲醇(55∶45);流速：1 ml/min;检测波长：302 nm;柱温：25℃;进样量：20μl。在此条件下，格拉司琼的保留时间约为9min，理论塔板数按格拉司琼峰计应不低于4 500。
       2.2.3 样品处理 在预定时间内处死大鼠，仔细剖开注射部位表皮，将凝胶连同周围组织切取下来，置于匀浆器中，冰浴，加入丙酮4 ml，反复研磨10 min，用流动相稀释至20 ml，涡旋混匀，12 000 r/min经高速离心15 min后，取上清液进样，HPLC检测。
       2.2.4 专属性实验如图1～2所示，肌肉匀浆液中的内源性物质和代谢产物以及载体材料PLGA对主药的测定均不产生干扰。
       2.2.5 标准曲线及定量限 取大鼠腹部肌肉加入丙酮适量制成匀浆液待用。配制50 μg/ml的格拉司琼溶液待用。取上述匀浆液3 ml，分别加入上述格拉司琼溶液0.1，0.2，0.5，1，2，5 ml，用流动相稀释至10 ml，旋涡混匀，制成浓度为0.5，1，2.5，5，10，25 μg/ml的样品溶液，经12 000 r/min高速离心15 min后，吸取上清液进样，作HPLC检测，以峰面积(A)对药物浓度(C)进行线性回归。得回归方程A=12.979C+0.720 3 (r=0.999 979)。结果表明，格拉司琼浓度在0.5～25μg/ml范围内与峰面积线性关系良好，定量限为0.026 μg/ml。
       图1 空白肌肉匀浆液加PLGA样品色谱图
       图2 注射格拉司琼凝胶后肌肉匀浆液样品色谱图
       2.2.6 精密度实验 取线性项下2.5，5和10 μg/ml的标准溶液，分别连续测定6次，计算RSD。结果RSD为1.76%，表明本方法精密度好。
       2.2.7 回收率实验取空白匀浆液3 ml，加入适量PLGA(溶于丙酮中)，再分别加入上述格拉司琼溶液0.2，1，5 ml，用流动相稀释至10 ml，涡旋混匀，配制成浓度为1，5，20 μg/ml的样品溶液，经12 000 r/min高速离心15 min后，吸取上清液进样，作HPLC检测。结果见表1。表1 回收率实验结果加入浓度/μg·ml-1测定浓度/μg·ml-1回收率(%) 平均回收率(%)结果表明格拉司琼回收率良好。
       2.3 大鼠体内累积释放率研究将48只大鼠随机分成8组，每组6只，按照每只33mg格拉司琼原位凝胶的剂量，给予大鼠皮下注射，通过回称注射器中残留的凝胶计算出实际给药量。大鼠回笼饲养，于注射凝胶1.5 h，1，2，3，4，5，6，7 d后处死大鼠，剖开注射部位表皮，将凝胶连同周围组织切取下来，制成匀浆液，按照“2.2.3”项样品处理方法进行操作，HPLC测定凝胶药物残留量，以此换算出格拉司琼在大鼠体内的累积释放率。
       局部残留量法间接测定大鼠皮下注射格拉司琼凝胶后的药物累积释放率结果见表2，图3表2 格拉司琼在大鼠体内的累积释放率时间累积释放率(%)12 3 45 6平均值(%)RSD(%)
       3 讨论
       注射给药的原位凝胶注入体内后，由于温度的变化，迅速由溶液状态转变为半固体状凝胶，药物在扩散作用和凝胶自身降解作用的双重推动下，从凝胶中平稳的释放出来，从而达到缓释作用。格拉司琼口服首过效应明显[5]，生物利用度低，所以注射型凝胶给药系统有显著优势。
       图3 格拉司琼在大鼠体内的累积释放率
       本实验所使用的有机溶剂NMP已获FDA批准用于制备注射型原位凝胶植入剂;用于制备格拉司琼原位凝胶的辅料-PLGA是一类很有研究价值和应用前景的生物可降解高分子材料，它由无毒、生物相容的单体聚合而成，水解产物为乳酸和羟基乙酸，而最终的代谢产物是二氧化碳和水。
       本实验所采用的局部残留量法测定凝胶在大鼠体内的累积释放率借鉴了国外检测黄体激素释放激素(LHRH)的方法[6]。由释放曲线可知，1.5 h后发生突释效应，释放量达17.1%，7 d后，凝胶累积释放率为97.27%，基本释放完全。
       【参考文献】
         　　[1] Saner GJ，Nelon DR.Jelective and functional 5-hydroxytryptamines 3 receptor antagonism by BRL 43694(granisetron)[J].Eur J Pharmacol，1989,159(2):113.
       
       [2] 红 远，凌树森.格拉司琼的研究进展[J].中国临床药理学杂志，1999，15(5)：374.
       
       [3] Pinguet F，Bressolle F，Martel P，et al.High-performance liguid chromatographic determination of granisetron in human plasma[J].J Chromatogr B Biomed Appl，1996，675(1):99.
       
       [4] 夏保云，吴强，何广卫.HPLC法测定盐酸格拉司琼片剂的含量[J].药物分析杂志，2000，20(4):257.
       
       [5] 陶 欣，朱秀平，卓海通，等.盐酸格拉司琼片剂人体生物利用度和药代动力学研究[J].中国临床药理学杂志,1999,15 (1):45.
       
       [6] Yasuaki Ogawa，Hiroaki Okada，et al.Controlled Release of LHRH Agonist，Leuprolide Acetate，from Microcapsules: Serum Drug Level Profiles and Pharmocological Effects in Animals[J].J Pharm Pharmacol，1989，41:439.