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       【摘要】 
       目的探讨肃肺润肠汤对药物依赖性便秘大鼠大肠杯状细胞、5-HT的变化。方法清洁级SD大鼠45只，随机分为正常对照组(n=15)，大黄模型组(n=15) 和大黄模型治疗组(n=15)以下分别简称对照组、模型组、治疗组。除对照组外，模型及治疗组先建立大鼠药物依赖性便秘模型，在模型基础上，治疗组大鼠给予肃肺润肠汤灌胃治疗，再采用普通组织学、免疫组织化学SABC法和细胞计数进行研究在给中药复方前后的大鼠大肠杯状细胞、5-HT免疫反应细胞的形态分布及数量的变化。结果与模型组比较，治疗组大肠杯状细胞、5-HT细胞数量均增加，差异非常显著(P<0.01)，且后者免疫染色强度增强。结论肃肺润肠汤可以提高药物依赖性便秘大鼠肠道杯状细胞、免疫反应细胞5-HT的形态分布和数量，从而促进胃肠蠕动，改善胃肠道的传输功能。
       【关键词】  肃肺润肠汤; 药物依赖性便秘模型; 杯状细胞; 5-HT
       药物依赖性便秘是指便秘之人长期服用泻剂，引起泻剂成瘾，不服用泻剂则不能排便，以致越泻越秘[1]。当前对于不危及生命但又影响生活质量的本病，研究多不深入。本实验所研究的肃肺润肠汤[2]是治疗药物依赖性便秘的临床经验方，继我们成功建立该动物模型后，又应用肃肺润肠汤对药物依赖性便秘大鼠的杯状细胞、5-HT免疫反应细胞所发生的形态及数量变化进行了初步研究。现报道如下。
       1 材料与仪器
       1.1 动物实验动物：大鼠，雌性，日龄45～55 d，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。
       1.2 仪器光学显微镜:日本Olympus公司生产。
       1.3 药物①生大黄，由贵阳市同济大药房提供，甘肃省产，生产批号05053001。生大黄溶液的配制;生大黄浸泡12 h，绞汁过滤后，装入烧杯，放入40℃的恒温水箱，浓缩至含生药1 g/ml，4℃冰箱保存，使用前复温。②肃肺润肠汤的组成：阿胶10 g，苏子15 g，杏仁10 g，枳壳10 g，沉香4 g，等，贵阳市同济药堂提供，将上述药物按人和动物比例折算用量，配制及保存同生大黄。
       1.4 试剂兔抗5-HT(工作浓度：1∶200，北京中杉金桥生物技术有限公司);羊抗兔IgG和SABC复合物(工作浓度：1∶100，武汉博士德生物工程公司)。
       2 方法
       2.1 造模方法
       2.1.1 动物分组清洁级SD大鼠45只，体质量180～220 g，雌性，随机分为对照组(n=15)，模型组(n=15)，治疗组(n=15)，单笼饲养。室温22～25℃，湿度<60﹪，噪音<50dB。
       2.1.2 模型建立[3]大鼠适应性饲养3 d后称重，造模组不禁食限水，致大鼠形成便秘[4]，1周后用大黄水溶液灌胃给予治疗[5]，起始剂量均为20 mg∕(100 g·d); 按每天20 mg∕(100 g·d)递增，至约半数以上动物出现稀便时，再维持此剂量不变直到稀便消失，使大鼠对药物产生依赖，再逐渐停止限水;同时按20 mg/(100g·d)递增，保持半数以上动物出现稀便现象饲养3个月，大黄最终用量320 mg/(100g·d)。正常对照组每天以蒸馏水1.5 ml/100g灌胃1次。各组连续灌胃6 d，停药1 d。
       2.1.3 取材及普通组织学标本制备成功建立大鼠药物依赖性便秘模型并经治疗后，颈椎脱臼法将大鼠处死，迅速取结肠近端(离盲肠约1 cm)及远端(离肛门约2 cm)各一段约2 cm，生理盐水冲洗，放置10﹪福尔马林液体中固定，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，HE染色。
       2.1.4 免疫组织化学SABC法按免疫组织化学SABC法进行免疫组织化学染色，显示5-HT免疫反应细胞。主要步骤：切片常规脱蜡至水，室温10%甲醇-H2O2 10 min，正常山羊血清(1∶50)室温下封闭30 min，依次滴加兔抗血清4℃孵育过夜，羊抗兔IgG(1∶100)37℃下孵育20 min，SABC复合物(1∶100)37℃下孵育20 min，DAB- H2O2液显色，苏木精复染细胞核，中型树胶封片。
       2.1.5 细胞记数选取各组大鼠大肠切片，在200×物镜下，每张切片随机选取10个视野，分别记数每个视野内有核阳性5-HT-IR细胞数。
       2.2 治疗方法①模型组，只造模不灌服肃肺润肠汤;②治疗组，在造模完成后再灌服肃肺润肠汤15 d;③对照组每天以蒸馏水1.5 ml∕100 g灌胃1次至实验结束。
       2.3 统计处理所得数据用±s表示，采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01，表示差异非常显著。
       3 结果
       3.1 一般情况在实验过程中，实验各组没有动物死亡。对照组大鼠体胖、行动活跃、精神良好、皮毛润泽、饮食不减，实验后体重、食量随增龄明显高于实验前。模型组大鼠形体消瘦，活动减少，皮毛色泽发黄无光泽且脱落严重，纳差，精神萎靡，造模后体重明显低于造模前，粪便排出量少、质硬，肠道的传输功能减慢。治疗组一般情况较好，粪便排出量增多、质软，肠道的传输功能减慢得到改善。
       3.2 肠道普通组织学HE染色实验各组肠道肠无特殊改变，但模型组肠道肠杯状细胞数量(随机选择10个200×视野，取其平均值)比对照组减少，差异非常显著(P<0.01);治疗组杯状细胞数量比模型组增多，差异非常显著(P<0.01)，但比对照组也有显著差异(P<0.05)。结果见表1。
       3.3 大肠5-HT-IR细胞的光镜免疫组织化学观察光镜下，对照组大肠5-HT-IR细胞经DAE-H2O2显色，可见免疫反应产物呈棕黄色至棕黑色颗粒状存在细胞质内。5-HT-IR细胞主要分布于肠绒毛上皮细胞以及肠腺上皮之间。与对照组比较，模型组5-HT-IR细胞形态分布由黏膜转到黏膜下层，且免疫染色减弱，反应产物呈淡黄色，尤其是细胞数量减少，差异非常显著(P<0.01);治疗组比对照组也有显著差异(P<0.05)。结果见表1及图1～3。
       3.4 大肠杯状细胞、5-HT-IR细胞计数的结果各组大鼠大肠杯状细胞计数5-HT-IR细胞计数的比较如表1所示模型组较正常对照组大肠杯状细胞数及5-HT-IR细胞数/10视野减少(随机选择10个20×视野，取其平均值)P<0.01，治疗组则较同期模型组增多(P<0.01)，差异极显著有统计学意义。表1 各组大鼠大肠杯状细胞、5-HT-IR细胞计数/视野(±s)
       4 讨论
       杯状细胞是肠道的正常细胞，有分泌粘液，润滑和保护肠道粘膜的作用[6]。5-HT主要来源于胃肠道的肥大细胞、EC细胞、部分胃肠道肌间神经丛神经元及黏膜下神经丛的神经节纤维，其不仅是重要的肠道神经递质，也是重要的免疫调节因子 ，它可通过多种受体直接作用于多种免疫细胞，是神经 - 内分泌 - 免疫调节网络中的重要成分[7]。研究发现，药物依赖性便秘大鼠杯状细胞、5-HT免疫反应细胞的减少，可能是造成该病的主要因素之一 [8]。图1 对照组 图2 模型组 图3 治疗组　大肠5-羟色胺 大肠5-羟色胺 大肠5-羟色胺(5-HT，200×) (5-HT，200×) (5-HT，200×)
       通过本实验的观察，我们发现，治疗组较模型组大肠的杯状细胞增多(P<0.01)，差异非常显著，由于杯状细胞增多，可能其分泌粘液的功能得到提高，肠道的润滑程度也就加强了，从而可能促进了肠道传输功能;治疗组较模型组大肠5-HT-IR细胞也明显增多(P<0.01)，差异也非常显著，免疫染色强度增强，分布也由黏膜下层转到黏膜层。这些提示，大肠5-HT的分泌与合成均提高了。由于大肠5-HT兴奋性神经递质的增高，平滑肌收缩加强，肠蠕动加快，结肠推动运动增强，于是可能出现了肠道传输性功能加快的发生;另外，由于5-HT也是重要的免疫调节因子，5-HT免疫反应细胞增加也可能提高了机体免疫功能，原结肠有效的推动性运动减弱得到改善;虽然治疗组较模型组杯状细胞增多，但与对照组相比，大肠的杯状细胞数量还是减少，(P<0.05)，差异显著。说明治疗组大肠的杯状细胞并没有恢复到正常水平，这是否与药物的剂量、给药时间的不足以及人与动物的体质差异有关，其机制还有待进一步研究。
       总之，引起药物依赖性便秘的因素是复杂的、多方面的，通过从本实验的研究观察，肃肺润肠汤可以改善药物依赖性便秘大鼠肠道杯状细胞、免疫反应细胞5-HT的形态分布和数量从而促进胃肠蠕动，改善胃肠道的传输功能，充分说明中医药治疗该病有潜在的前景。
       【参考文献】
         　[1] 胡伯虎.大肠肛门病治疗学[M].北京：科学技术文献出版社，2001:190.
       
       [2] 巫全胜，龙 辉，陈志懿，等.肃肺润肠汤治疗药物依赖性便秘的临床研究[J].贵阳中医学院学报，2005， 27(4)：21.
       
       [3] 巫全胜，钱 宁，赵菊花，等.大鼠药物依赖性便秘模型的制作[J].实验动物科学，2007，24(4)：70.
       
       [4] 王朝晖，赵延红，肖美芳，等.大鼠便秘模型制作的初步实验研究[J] .现代中医药， 2004，3：53.
       
       [5] 王 梅，吕 宾，范一宏，等.刺激性泻剂对大鼠肠道传输功能的影响[J].浙江医学，2005，27(4)：261.
       
       [6] 邹仲之.组织学与胚胎学，第5版[M].北京：人民卫生出版社，2001:160.
       
       [7] Furness JB，Costs M.Neurons with 5-hydroxytryptamine -like immunoreactivity in the enteric nervous system:their projection in the guinea-pig small intestine[J].Neuroscience，1982，7(6)：341.
       
       [8] 巫全胜，钱 宁，吴曙光，等.药物依赖性便秘大鼠杯状细胞及5-HT 变化的实验研究[J] .实验动物科学，2008，25(3)：11.