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       【摘要】 
       目的研究砂仁挥发油最佳提取工艺及提取物的化学成分。方法采用均匀设计法以提取时间、浸泡时间、溶剂量、粉碎度为因素，考察水蒸气蒸馏法提取砂仁挥发油的最佳提取工艺，通过气-质联用仪分析样品中挥发油的成分，采用综合评分法对挥发油的成分进行加权和DPS数据处理系统进行数据分析，从而研究4个因素与挥发油的关系。结果以砂仁挥发油提取率为指标的最佳提取条件：提取时间450 min，水量182ml，浸泡时间21 min，药材粒度为原药材;以砂仁挥发油化学成分为指标的最佳提取条件：提取时间445 min，水量191 ml，浸泡时间22 min，药材粒度为原药材。并且从提取物中分离出43个可识别峰，共鉴定42个成分，主要成分为乙酸龙脑酯、樟脑、柠檬烯、合成右旋龙脑、莰烯、龙脑。结论采用均匀设计方法可以快速、准确地确定水蒸气蒸馏法提取砂仁挥发油的最佳工艺，为砂仁进一步开发利用提供实验依据。
       【关键词】  砂仁; 挥发油; 多指标; 均匀设计; GC-MS分析
       砂仁是姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.，绿壳砂Amomum villosum Lour.var.xanthioidesT.L.W et Senjen和海南砂Amomum villosum.longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实[1]，以广东阳春县所产阳春砂最著名，称为地道南药砂仁。砂仁性辛、温，归脾、胃、肾经，有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎之功效，用于治湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等。砂仁主含挥发油，但挥发油为混合物，组成和性质均不稳定，挥发油成分的高低及其提取效果直接影响着砂仁的药用价值。目前对砂仁中挥发油提取方法涉及到水蒸气蒸馏、超临界萃取、溶剂热萃取法、固相微萃取、微波萃取等，采用GC-MS分析鉴定挥发油中成分及相对含量[2]。提高挥发油的提取率可提高药材利用率，这是提取工艺研究的重要目标，仅以总挥发油含量难以保证砂仁的品种与质量，应增设挥发油主要成分含量作指标依据控制砂仁药材质量。为此，我们采用水蒸气蒸馏法提取砂仁挥发油，选用均匀试验设计表U9(94)，对提取时间、浸泡时间、溶剂量、粉碎度进行均匀实验，将得到的挥发油进行GC-MS分析，揭示因素与砂仁挥发性成分结构分布及相对含量的关系，从而提出充分保存挥发成分前提下提取砂仁油的适宜的条件。
       1 材料与仪器
       1.1 材料砂仁药材，购自广州清平药材市场，产地：广东，经广东药学院中药鉴定教研室李书渊教授鉴定为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果实;无水乙醚、无水硫酸钠，均为分析纯;水为自制超纯水。
       1.2 仪器HP5890GC/HP5972MS 气/质联用仪(美国安捷伦公司)，1μl微量进样器(上海安亭科学仪器厂)，AY120型电子分析天平(上海岛津商贸有限公司)，TC-15型恒温电热套(海宁市华星仪器厂)。
       2 方法与结果
       2.1 试验方法将砂仁药材粉碎，精密称取30 g，置于圆烧瓶中，加一定量水，进行挥发油提取，回流提取，收集挥发油。各次试验中该条件保持不变，按照均匀设计安排进行实验，以提取物得率及化合物为评价指标，考察各因素水平对挥发油提取效果的影响，得出最佳工艺条件。
       2.2 均匀实验设计通过预试验，发现对挥发油提取物得率影响最大的因素有提取时间、浸泡时间、溶剂量、粉碎度。我们选用均匀试验设计表U9(94)进行最佳提取工艺的筛选。因素水平见表1，实验安排及结果见表2。
       2.3 提取率为指标的结果与数据处理将表2得到的结果利用均匀设计数据处理软件(DPS 9.50标准版)进行均匀设计回归分析，回归数学模型为：Y=1.728 199 166+0.004 880 140 37X1- 0.002 131491 767X2-0.013 177 500 94X3 -0.005 611 071 11X4。显著水平P值=0.158 1;F值=2.973 7;相关系数R=0.865 068;决定系数R2=0.748 3;剩余标准差SSE=0.503 592 23;调整后的相关系数Ra=0.704 759。根据回归方程，求出最佳组合见表3。表1 均匀设计试验因素水平　试验号X1提取时间t/minX2水量V/mlX3浸泡时间t/minX4药材目数　表2 均匀设计试验安排及结果试验号X1提取时间t/minX2水量V/mlX3浸泡时间t/minX4药材目数提取率(%)表3 均匀性设计试验提取率最佳组合　回归系数T检验的结果见表4。被引入的有4个回归项，即X1、X2、X3、X4，其中X1差异显著，说明提取时间对挥发油提取率影响较大。表4 各回归项回归系数的t检验结果
       由回归方程因素的系数可见提取时间对砂仁挥发油成分的提取率的影响为正效应。由最优方案可知：提取时间为最大值(X1=449.4 min)，水量、浸泡时间和药材目数取最小值(X2=181.9 ml，X3=20.34 min，X4=1.029目)，说明尽可能加长提取时间可使砂仁挥发油提取率升高。
       2.4 砂仁挥发油的GC-MS分析
       2.4.1 气相色谱条件气相色谱条件：色谱柱: Cpsil 5CB(Varian) 30 m×0.25 nm×0.25 m (100%苯甲基硅氧烷);载气为氦气 ;流量为1.0 ml/min;柱程序升温: 起始温度60℃保持6 min，以2℃/ min速度升至130℃，以5℃/min速度升至175℃，保持2 min;进样方式：不分流;进样量：1 μl(无水乙醚溶液);进样口温度：250℃。
       2.4.2 质谱条件离子源为EI;电离电压: 70 eV;电子倍培电压:1 929 mV ;质谱Temp：168℃;Vacuum：65 mTorr;溶剂延时：5 min ;质谱扫描范围：50～550 amu;扫描质量范围：50～550 m/z;样品经峰纯度检测;Wiley 138谱库检索。
       2.4.3 砂仁挥发油中各组分的相对百分含量测定按照上述的GCMS条件对砂仁挥发油进行分析，得到总离子流图，每个组分的质谱图经计算机质谱库检索及人工解析并与标准谱图核对，共分离出43个可识别峰，鉴定42个成分，主要成分为乙酸龙脑酯、樟脑、柠檬烯、合成右旋龙脑、莰烯、龙脑，用峰面积归一化法确定各组分在挥发油中的相对含量。结果见表5表5 砂仁挥发油样品中化学成分的相对百分含量(%)-”表示该样品中未检出该成分
       2.4.4 挥发油化学成分为指标的均匀分析一项试验，常常需要2个或更多的指标来衡量其效果。在多指标试验中，各试验因素及其水平对各试验指标的影响往往是不同的，在众多的指标中，有的指标要求越大越好，有的要求越小越好，有的则要求靠近某目标值为好。因此，分析多指标试验结果时必须统筹兼顾，寻找使各指标都尽可能好的条件。本次试验采用均匀试验，需要考察的指标不止一个，同一因素水平对各项指标的影响各不相同，故对试验结果数据的分析应从各方面考虑，兼顾得失，综合决定因素主次及最优水平组合。常用的对多指标试验结果数据的分析有“综合评分法”和“综合平衡法”，但在综合平衡时往往较为困难，也无法解决复杂的多指标问题。综合评分法只要给出评分方法，一般情况下分析计算较为方便。本试验采用“综合评分法”。
       综合评分法是一种将多指标按着一定的规则转换为单指标的方法。具体来讲，它是综合比较各种指标的重要性及其实测值，对每号试验结果评定出一个综合分数，而以此分数作为单指标进行统计分析。本试验利用一个包含有各项指标加权系数(权值)的公式计算每号试验结果的综合评分。加权系数的大小由指标的重要程度来决定，指标越重要加权系数越大。这种方法对指标乘以相应的加权系数得该项指标的加权评分，再把每号试验的所有指标的加权评分相加即得综合评分。
       在本实验中，参阅相关文献[2～5]可以发现本次实验分离鉴定出的砂仁挥发油化学成分中为主要有效成分并峰面积较大的成分有乙酸龙脑酯(给予加权系数550)、樟脑(给予加权系数235)、柠檬烯(给予加权系数40)、合成右旋龙脑(给予加权系数33)、莰烯(给予加权系数16)、龙脑(给予加权系数15)，其它化学成分按照酌情给予适合加权系数，各指标加权系数见表5，综合评分见表6。
       将表6得到的结果利用均匀设计数据处理软件(DPS9.50标准版)进行均匀设计回归分析，得到回归方程：Y=41 010.973 38+26.174 657 96X1-34.095 645 2X2-63.392 065 6X3 -31.255 527 84X4。显著水平p值=0.1119;F值=3.804 7;相关系数R=0.889 871;决定系数R2=0.791 9;剩余标准差SSE=2 520.147 604 73;调整后的相关系数Ra=0.764 030。根据回归方程，求出最佳组合见表7。
       表6 均匀设计砂仁挥发油化学成分综合评分试验数据表7 化学成分为指标均匀性设计试验最佳组合回归系数t检验的结果见表8。被引入的有4个回归项，即X1，X2，X3，X4，其中，X1差异显著，说明提取时间对挥发油化学成分影响较大。
       由回归方程因素的系数可见提取时间对砂仁挥发油成分的提取率的影响为正效应。由最优方案可知：提取时间为最大值(X1=444.764 6 min)，水量、浸泡时间和药材目数取最小值(X2=190.644 7 ml，X3=21.22 min，X4=1.0142目)，说明尽可能加长提取时间可使砂仁挥发油提取率升高表8 各回归项回归系数的t检验结果
       2.4.5 挥发油化学成分直观分析我们由9个砂仁样品挥发油特征图谱及表5发现，在不同的提取条件下，水蒸气提取砂仁挥发油得出的挥发油成分有较大差异，在图谱上可以见到特征峰在30 min之前是基本一致的，在30 min之后，特征峰的数量和位置是不同的。9个样品共检出42个成分，主要共同的成分有2-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、松油烯、芳樟醇、樟脑、龙脑、异龙脑、乙酸龙脑酯，因提取条件的不同，有些成分出现在个别的样品中，如表5;根据42个化学成分的性质，按照其结构分为无环单萜、单环单萜、双环单萜、无环倍半萜、单环倍半萜、双环倍半萜和三环倍半萜，如表9所示。
       样品1中挥发油成分大致为单萜类化合物，因为提取时间少，相对分子量较大的倍半萜类化合物还没有提取出来，所以本样品中以单萜类化合物为主，其主要成分为乙酸龙脑酯(52.02%)、樟脑(35.589%)、合成右旋龙脑(6.774%)、柠檬烯(1.757%)等。
       样品2中挥发油成分以单萜类化合物为主，比样品1中的成分多，其原因为浸泡时间长，使砂仁有更多的时间与水接触，得出的成分较多。主要成分为乙酸龙脑酯(36.268%)、樟脑(40.283%)、龙脑(6.528%)、柠檬烯(3.217%)、莰烯(3.123%)等。
       样品3中挥发油成分为单萜和倍半萜，尤其以单萜为主，原因为砂仁为捣碎颗粒，有充足的表面积与水接触，且提取时间加长至180min，有利于挥发油的蒸出。主要成分为乙酸龙脑酯(44.636%)、樟脑(17.676%)、龙脑(3.925%)、а-姜黄烯(3.76%)、榧烯醇(3.749)等。
       样品4中挥发油成分增多，还有一些烷烃，与样品3的差别在于药材浸泡时间和药材粒度。主要成分为乙酸龙脑酯(51.162%)、樟脑(21.629%)、柠檬烯(4.012%)、合成右旋龙脑(3.648%)、莰烯(3.089%)、橙花叔醇(3.246%)等。
       样品5中挥发油成分为单萜和倍半萜，单萜为主，原因为提取时间有300min，使砂仁内的挥发油随水蒸气馏出时间加长，其成分中相对分子量高的倍半萜成分馏出增多。主要成分为乙酸龙脑酯(60.718%)、樟脑(20.377%)、柠檬烯(4.428%)、合成右旋龙脑(3.937%)等。
       样品6中的成分以单萜为主，还有一些烷烃，无倍半萜成分馏出。主要成分为乙酸龙脑酯(57.907%)、樟脑(21.554%)、柠檬烯(6.013%)、合成右旋龙脑(3.629%)、莰烯(3.066%)等。
       样品7中的成分以单萜为主，次之为倍半萜，与样品6相比，为药材粒度的不同，使得本样品中含有倍半萜。主要成分为乙酸龙脑酯(64.789%)、樟脑(15.58%)、合成右旋龙脑(3.782%)、柠檬烯(3.722%)等。
       样品8中的成分以单萜为主，倍半萜次之，因为本实验的提取时间、水量、浸泡时间比其它样品实验多，使提取的化学成分较多。主要成分为乙酸龙脑酯(61.362%)、樟脑(18.762%)、柠檬烯(5.126%)、合成右旋龙脑(3.783%)等。
       样品9中的成分为单萜和倍半萜，本实验的提取条件为9个样品之最，得出的成分最多。主要成分为乙酸龙脑酯(52.453%)、樟脑(12.943%)、柠檬烯(3.753%)等。
       3 讨论
       均匀试验设计的基本思想是抛开正交设计中“整齐可比”的特点而只考虑实验点的“均匀分散”性，即让试验点在所考察的范围内尽量均匀地分布。由于不考虑“整齐可比”性，在正交试验中为整齐可比而设置的试验点可不再考虑，因而可大大减少试验次数，且试验次数与各因素所取的水平数相等。均匀设计试验是一种较好的试验条件优化方法。只要我们正确运用均匀设计，这种方法不仅可以减少试验次数、提高效率，而且可以节约时间和经费。 本试验是采用多指标均匀设计试验优选砂仁挥发油的水蒸气提取工艺，以提取时间、水量、浸泡时间和药材粒度作为四个因素设计均匀实验。试验得出的数据在DPS数据处理系统中作回归处理分析，从而分析出最佳的提取工艺。
       在试验过程中发现影响砂仁挥发油提取率的因素：①砂仁的粒度，砂仁不是粉碎越小越好，而是在一定的粒度下，才能提取出最多的油量，因为粉末会吸附挥发油，使油不能随水蒸气蒸出;②提取时间，提取时间过短则不能有效地提取出砂仁中的挥发油成分，时间过长则可能会导致挥发油的流失;③圆底烧瓶的容积，圆底烧瓶的容积与水量有关，圆底烧瓶中的水一定不能超过烧瓶容积的2/3，若超过了，会容易引起爆沸现象，使烧瓶中的砂仁随水流入收集挥发油的装置中。
       表9 砂仁挥发油化学成分性质“-”表示未查出数据
       在本试验中砂仁挥发油提取率为指标的均匀分析显示，最佳条件为：提取时间450 min，水量182 ml，浸泡时间21 min，药材目数1。砂仁挥发油化学成分的多指标均匀分析显示，最佳条件为：提取时间445 min，水量191 ml，浸泡时间22 min，药材目数1。
       在同一均匀试验中，分别用提取率和化学成分两个指标，对砂仁挥发油的提取工艺进行分析，得到的均匀试验最佳组合基本接近。提取率的均匀分析是在最佳条件下提取最多的挥发油;而化学成分均匀分析是在最佳的条件下利用加权系数对挥发油中的化学成分进行综合评分，从而分析出挥发油化学成分在最佳提取工艺。
       本试验提取挥发油的溶剂是水，提取得到的成分以单萜和倍半萜为主，设计了多指标均匀试验，每个水平试验得到的挥发油成分存在差异，共同的成分为乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、芳樟醇、柠檬烯、莰烯、2-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯等。从沸点角度探讨，改变挥发油提取时的温度条件，可以提高挥发油中倍半萜的提取率，因为倍半萜类是挥发油高沸程(250～280℃)的主要成分。通过改变提取条件，可以提取出不同的挥发油成分。魏荣华等[6]通过采用石油醚、正己烷、乙醚、乙醇四种溶剂在微波的条件下得到砂仁挥发油41种化学成分，经过GC-MS分析鉴定，其成分以樟脑和柠檬烯为主。何正洪等[7]采用临界二氧化碳萃取砂仁挥发油，经过GC-MS分析鉴定得出13个成分，主要是乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、莰烯等。在实验研究中，分析鉴定中药的化学成分，采用不同的条件，得出的结果不尽相同，这需要我们的进一步的研究，可发掘出尚未发现的成分和用途。
       【参考文献】
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       [2] 颜 艳.中药砂仁的研究进展[J].中国中医药科技，2007，14(2)：304.
       
       [3] 尹 雪，魏 刚，何建雄，等.阳春砂仁GC-MS特征指纹图谱数字化信息的GC验证[J].中药新药与临床药理，2008，19(6)：473.
       
       [4] 宋国新，邓春晖，吴 丹，等.静态顶空-固相微萃取-气相色谱/质谱分析砂仁的挥发性成分[J].复旦学报(自然科学版)，2004，43(4)：676.
       
       [5] 李晓瑞，李奉勤，薛彦朝，等.中药挥发油提取工艺研究概况[J].中医药管理杂志，2006，14(8)：66.
       
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       [7] 何正洪，刘 虹，沈美英.超临界二氧化碳萃取砂仁精油化学成分的研究[J].广西林业科学，1996，25(3)：132.