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       【摘要】 
       目的建立刺五加中刺五加苷E含量的测定方法，并比较不同产地的刺五加中刺五加苷E含量，为进一步研究不同品系的刺五加中刺五加苷E的含量与其遗传学的关系奠定基础。方法刺五加苷E的提取采用超声提取法;选用YMC ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，检测波长220 nm，以0.1%磷酸水溶液-乙腈(89∶11)为流动相，体积流量1.0 ml/min。结果超声波提取法对刺五加苷E提取率稍低于溶剂提取法，但操作简便，耗时较短。刺五加苷E的线性范围为0.625～10.004 μg(r = 0.999 92);平均回收率为100.64%，RSD为2.97%。结论建立的刺五加苷E提取和测定方法适合于快速准确地分析大量样品。
       【关键词】  刺五加; 刺五加苷E; 高效液相色谱法
       HPLC Determination of Eleutheroside E in Eleutherococcus senticosus from Different Provenances
       WU Shaojie1，2，
       XING Zhaobin2*，
       LAO Fengyun2，
       ZHAO Baorui2
       (1. Marine Department of Huaihai Institute of Technology, Lianyungang,222005,China; 2. North China Coal College of Medicine, Tangshan, 063000,China)
       Abstract：Objective To establish a method for determination of Eleutheroside E content in Eleutherococcus senticosus from different provenances, which will afford a base for further research on the relationship between the heritage of Eleutherococcus senticosus and the content of Eleutheroside E.
       MethodsA supersonic extraction method was adopted for the extraction of Eleutheroside E.HPLC determination conditions were as follows:YMC ODS column (150 mm×4.6 mm, 5 μm), water containing 0.1% phosphoric acid and acetonitrile (89∶11) as mobile phase, with a flow rate of 1.0 ml/min, and UV detect wavelength 220 nm.
       ResultsAs compared with organic solvent extraction method, supersonic extracting method was easy and time-saving, despite its slightly low extracting rate. The linear range of Eleutheroside E was 0.625-10.004 μg (r = 0.999 92),average recovery coefficient was 100.64%, RSD = 2.97%.
       ConclusionThe determination method is suitable for the precisely analysis of Eleutheroside E.
       Key words：Eleutherococcus senticosus; Eleutheroside E; HPLC
       剌五加为五加科植物刺五加Eleutherococcus senticosus的干燥根、茎及根茎。《本草纲目》记载“刺五加能补力益精，明目下气”，“能补五劳七伤，久服轻身耐老”;具有益气健脾、补肾安神之功[1] 。现代药理证明，刺五加能增强人体的抗疲劳及适应性、防辐射、调节免疫功能及抗癌等作用[2] 。其主要成分为紫丁香苷、刺五加苷和异秦皮啶等[3]。
       刺五加在我国东北和华北北部均有分布，作者发现不同产地的刺五加之间在遗传学上存在着一定的差异[4]，目前正在研究这些遗传学差异与刺五加苷E生物合成的关系。本研究试图建立刺五加苷E的测定方法并比较不同产地、不同部位的刺五加中刺五加苷E含量的高低，为进一步研究刺五加苷含量差异与其遗传学差异的关系提供基础。
       1 设备与材料
       1.1 仪器HP-1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司生产)，四元泵，紫外检测器，HP色谱工作站;KDC-16H高速台式离心机;RE-52ZZ旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂);万分之一电子天平(上海亚荣仪器厂);KQ3200DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
       1.2 药材与对照品刺五加苷E对照品，购自中国药品生物制品检定所。
       药材采自吉林梅河口、柳河、集安、珲春和辽宁本溪，经华北煤炭医学院药学系韩刚教授鉴定，为五加科植物刺五加E. senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms。
       1.3 试剂磷酸(天津市微通化学试剂有限公司)，色谱纯乙腈(天津市四友生物医学技术有限公司出品，高效液相色谱专用)。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件 YMC ODS液相色谱柱 (150 mm× 4.6 mm, 5 μm);柱温30℃，检测波长220 nm，体积流量1.0 ml/min，流动相为0.1 %磷酸水溶液-乙腈(89∶11)。此条件下，样品中刺五加苷E与两侧相邻色谱峰的分离度分别为2.94和2.98，分离效果良好;对刺五加苷E分离的理论塔板数为2.14 × 104，色谱图见图1。*- 刺五加苷E图1 刺五加苷E对照品(A)和刺五加(B)的HPLC图
       2.2 对照品溶液配制精密称取0.5 mg对照品，用50%甲醇定容至10 ml，于4℃冰箱中保存。精密吸取一定量上述溶液置于另一10 ml容量瓶中并用50%的甲醇定容;按照此方法依次配制不同浓度的的刺五加苷E标准溶液。
       2.3 样品处理与刺五加苷E的提取刺五加植株洗净，根和茎分开，阴干后将根和茎分别切成薄片，置于烘箱中60℃烘干至恒重后粉碎，粉末过20目筛。实验比较了两种提取方法——回流提取法和超声提取法：精确称取刺五加根和茎的粉末2.5 g各2份，一份用50%的甲醇溶液85℃回流提取2 h后过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，残渣用50%甲醇溶解转移至10 ml容量瓶中定容;另一份超声(频率40 kHz，功率100 W，温度40℃)提取40 min，然后过滤、滤液蒸干并按同法配成溶液。HPLC测定刺五加苷E的含量。通过比较，发现二者提取效果相差不大，但由于超声提取法速简便，因此本研究采用超声提取方法。
       2.4 线性关系考察精密吸取不同浓度的对照品溶液20 μl，HPLC测定刺五加苷E的峰面积。采用Origin 7.0数据处理软件，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，得到直线拟合方程为 Y = 1 920.529 25 X + 250.707 22，r = 0.999 92，在所测量的范围内(0.625～10.004 μg)，线性关系理想。
       2.5 精密度实验 精密吸取刺五加苷E的对照品溶液20 μl，连续进样5次，测定其峰面积;得到RSD为1.02%，精密度良好。
       2.6 稳定性实验 精密吸取刺五加根样品(本溪产)溶液20 μl，每隔2 h进样1次，连续测定6次，测定刺五加苷E的含量，计算RSD= 1.07%，表明在10 h内刺五加苷E稳定性良好。
       2.7 重复性实验精密称取1.0 g刺五加根(本溪产)粉末6份，按“2.3”中超声提取法制备供试品溶液。测定结果的RSD为2.03%，重复性较好。
       2.8 加样回收率实验精密称取1.0 g刺五加茎(本溪产)粉末5份，精密加入一定量刺五加苷E对照品，然后按照“2.3”中超声提取法制备供试品溶液。经测定，平均回收率为100.64%，RSD= 2.97%，回收率较好。
       2.9 样品测定精密称取各样品药材粉末2.5 g，按照“2.3”中超声提取法提取各样品中的刺五加苷E，并测定其含量。测定结果见表1。表1 刺五加中刺五加苷E的测定
       3 讨论
       本研究比较了超声提取和回流提取两种方法对刺五加中的刺五加苷E的提取效果，发现回流提取法提取率略高于超声提取法，但两者相差不大。由于回流提取法操作繁琐、耗时较长，而超声提取法简便快速，适用于对大量样品进行提取和分析。
       在流动相的选择中，曾比较了不同比例的0.1 %磷酸水溶液-乙腈，还进行了梯度混合条件的摸索，最终确定为0.1 %磷酸水溶液-乙腈(89∶11)。在此条件下样品中刺五加苷E的色谱峰与周围色谱峰分离度较好。
       本研究建立的刺五加苷E的HPLC测定方法，简便快速，稳定可靠，重现性好，回收率高。研究发现5个产地的刺五加中，根中的刺五加苷E含量均高于茎;产地不同，刺五加苷E含量也存在一定的差异：根中刺五加苷E的含量以集安产区最高，而茎中刺五加苷E的含量以柳河产区最高;珲春产区刺五加苷E的含量显著低于其它产区。今后应当进一步研究珲春与其它产区的刺五加在遗传学上是否存在着显著差异，特别是在刺五加合成基因簇和关键酶基因上的差异，以便找出影响刺五加苷合成的遗传学因素，为进一步采用代谢工程手段改造刺五加苷生物合成基因、提高刺五加植株或细胞培养时刺五加苷的含量提供基础。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2000.
       
       [2] 李同华，魏为民，陈淑范.刺五加的经济价值及其生物技术研究 [J].农业与技术，2008，25(2)：57.
       
       [3] 杨书良，杨 渡，田 凤，等.大孔吸附树脂富集刺五加中紫丁香苷和刺五加总苷的研究[J].中草药，2008，39(9)：1327.
       
       [4] 邢朝斌，劳风云，吴 鹏，等.利用随机扩增多态性DNA技术分析刺五加的遗传多样性[J].时珍国医国药，2008，19(6)：1305.