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       【摘要】 
       目的观察天钩方对肾性高血压大鼠的降压作用，并探讨其可能的作用机制。方法应用“两肾一夹法”(2K1C)建立大鼠肾性高血压模型，观察不同剂量天钩方对模型大鼠血压、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和血清血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响。结果天麻钩藤制剂各剂量组均能明显降低模型大鼠的血压，显著升高模型大鼠血清SOD、GSH-Px和NO水平，明显降低血清中AngⅡ和MDA含量，NOS水平。结论天麻钩藤制剂降压作用确切，其作用机制可能与其具有显著的抗氧化作用改善内皮功能有关。
       【关键词】  天钩方; 肾性高血压; 抗氧化; 一氧化氮; 血管紧张素Ⅱ
       Experimental Study on the Treatment of Tiangou Decoction in Treating Renovascular Hypertension Rats
       YANG Lei，
       LI Hongyu，
       MI Suiqing，
       WANG Ningsheng*
       (Institute of Clinical Pharmacology of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou510405，China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Tiangou Decoction on antihypertension in renovascular hypertension rats and its possible mechanism.
       MethodsTwo-kidney, one-clip (2K1C) renovascular hypertension was induced in Sprague-Dawley rats, the effect of different doses of Tiangou Decoction on blood pressure, serum superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase(GSH-Px), angiotensinⅡ(AngⅡ) nitric oxide(NO), nitric oxide synthase(NOS) of experimental rat model were investigated.
       ResultsDifferent doses of Tiangou Decoction significantly reduced the blood pressure level, increased serum superoxide dismutase(SOD) and glutathione Peroxidase(GSH-Px) activities, increased serum nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) contents, and decreased angiotensinⅡ(AngⅡ),malondialdehyde (MDA) contents.
       ConclusionTiangou Decoction has significant effect of antihypertension. Its therapeutic mechanism may be related to the antioxidation function and improving endothelial function.
       Key words：Tiangou Decoction; Renovascular Hypertension; Antioxidation; Nitric oxide; AngiotensinⅡ
       高血压病的发生和演变是多因素、多层次交互作用的复杂过程，近期研究发现，氧化应激介导的血管内皮功能损伤、一氧化氮等血管内皮舒张因子失活是高血压病进行性发展及靶器官损害的重要机制之一，因此保护血管内皮、抗氧化是近期评价抗高血压药物疗效的一个重要途径。天钩方是在经典平肝潜阳复方天麻钩藤饮的基础上化裁而来，由天麻、钩藤、葛根、杜仲等中药材组成，本文拟采用“两肾一夹”法建立肾性高血压动物模型，探讨该方对模型动物的降压作用及其产生的可能机制。
       1 材料与仪器
       1.1 动物SD大鼠54只，SPF级，雄性，体质量(200±20)g，由广东省实验动物中心提供，动物合格证号：粤监证字2008D007。
       1.2 药物天钩方(天麻15 g，钩藤15 g，葛根15 g，杜仲10 g)购自广州中医药大学大药房，经生药学鉴定为合格药材，按照常规方法煎煮，并浓缩成所需浓度的浓缩药液备用。
       1.3 试剂与仪器SOD，MDA，GSH-Px，NO，NOS，iNOS测定试剂盒，均由南京建成生物技术有限公司，批号：20090911。AngⅡElisa试剂盒，由ALD公司提供，批号0905。无创血压测量仪(ALC-NIBP型)，上海奥尔科特生物科技有限公司;UV-260型紫外/可见光光度计，日本Shimadaz(岛津)公司;多功能酶标仪，SPECTRA FLUOR PLUS，澳大利亚;LXJ-IIB型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂。
       2 方法
       2.1 造模、分组与给药大鼠以10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后的大鼠仰卧固定于手术台上，剪去腹部体毛，5%碘伏消毒，75%酒精脱碘，盖上孔巾。沿腹正中线作手术切口打开腹腔，按无菌操作，小心钝性分离出左肾动脉，穿入无菌丝线，把直径为0.25 mm的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线扎紧肾动脉和针灸针后抽出针灸针，结果造成单侧肾动脉狭窄，对侧肾脏和动脉不触及。假手术组除结扎肾动脉外，其余手术操作均同上。术后3天内青霉素(3×104U/d)腹腔注射预防感染，造模4周后尾套法测量大鼠血压，每次重复3次取其均值，以尾动脉收缩压超过140 mmHg的大鼠作为模型大鼠。按血压高低分层后随机分为5组，每组8只，即模型对照组，阳性药物对照组，天钩方高，中，低剂量组，另设假手术组，共6组。按动物体表面积换算成等效剂量，天钩方高剂量组予20 g/kg体质量，中剂量组予10 g/kg体质量，低剂量组予5 g/kg体质量，阳性组给予依那普利1.8 mg/kg体质量，给药体积均为5 ml/kg体质量，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水，均为灌胃给药，2次/d，连续8周。
       2.2 血压测定采用尾动脉脉搏测压法，在大鼠安静状态下进行血压测定，连续测3次收缩压，取平均值作为测压结果。正式实验前，适应性测压约2周。待大鼠适应环境，血压稳定后，开始正式实验。
       2.3 样本采集大鼠末次给药30 min后，腹主动脉取血10 ml，4℃ 1 200×g离心10 min，分离血清，-70℃冰箱保存待测。
       2.4 指标检测 血清SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定;MDA采用TBA(硫代巴比妥酸)法测定;GSH-Px采用酶促反应法测定;NO采用硝酸还原酶法测定;NOS采用TBA(硫代巴比妥酸)法测定，AngⅡ采用Elisa法测定，均按试剂盒说明书操作。
       2.5 统计学分析数据均以±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析One-Way ANOVA。
       3 结果
       3.1 天钩方对肾性高血压大鼠血压的影响模型组血压与假手术组比较明显升高，各给药组均能降低模型大鼠血压，与模型组比较有显著差异(P<0.01)，天钩方各剂量组存在一定的量效关系。结果见表1。表1 天钩方对肾性高血压大鼠血压的影响
       3.2 天钩方对肾性高血压大鼠血清AngⅡ含量的影响与假手术组相比，模型组中大鼠血清AngⅡ含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显降低血清AngⅡ含量(P<0.01)，天钩方各剂量组对血清AngⅡ含量的影响呈现一定的剂量依赖关系。结果见表2。　　表2 天钩方对肾性高血压大鼠AngⅡ的影响
       3.3 天钩方对肾性高血压大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px的影响与假手术组相比，模型组中大鼠血清SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显增加(P<0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显提高血清SOD、GSH-Px酶活力(P<0.01)，降低血清MDA含量(P<0.01)。结果见表3。表3 天钩方对肾性高血压大鼠血清SOD，MDA，GSH-Px的影响
       3.4 天钩方对肾性高血压大鼠血清NO，NOS，iNOS含量的影响与假手术组相比，模型组中大鼠血清NO含量明显降低，血清NOS和iNOS的活性明显增加(P<0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显提高血清NO含量(P<0.01)，降低血清NOS和iNOS活性含量(P<0.05，P<0.01)。结果见表4。
       4 讨论
       在降压药物研究中，高血压动物模型的建立有多种方法，如盐性高血压、自发性高血压(SHR)、神经内分泌型高血压、肾动脉狭窄型高血压、肾外包扎型高血压等。其中肾动脉狭窄型方法的造模原理是狭窄肾动脉造成肾脏缺血，导致肾脏内肾素形成，血管紧张素Ⅱ含量升高，使血压升高。模型表现与临床高血压尤其是继发性高血压的病理生理学改变相似[1]。此法的手术成功率较高，可达到80%以上，术后大鼠血压稳步增高，到4周后形成稳定的高血压[2]。本实验造模4周后，与假手术组比较，模型大鼠收缩压均明显升高(P<0.01)，血清血管紧张素Ⅱ含量明显高于假手术组(P<0.01),表明RHR大鼠造模成功,可用于药物研究。模型大鼠按照血压水平分层后随机分组，各组间无显著差异(P<0.05)，然后进行正式实验。给药8周后，给药组各组大鼠的收缩压与模型组比较明显降低(P<0.01)，并能够明显降低模型大鼠血清血管紧张素Ⅱ含量(P<0.01)，在给药剂量范围内呈剂量依赖性降低关系。表明天钩方具有良好的降血压作用。表4 天钩方对肾性高血压大鼠血清NO，NOS，iNOS含量的影响
       现代研究显示，内皮功能损伤是高血压病产生及发展过程中的重要病理表现，高血压病出现内皮功能损伤的机制是多方面的，其中氧化应激产物堆积降解NO是其重要的机制之一。NO是由NOS通过将底物L-精氨酸的胍基氮原子末端的5个电子氧化形成L-胍氨酸的同时产生的。NO自由扩散到邻近的血管平滑肌细胞内，激活一系列的G蛋白激酶，从而引起血管舒张[3]。NO对血管张力和血压的调节具有非常重要的作用，许多研究均表明，自发性高血压大鼠(SHR)及原发性高血压(EH)患者血清NO水平下降，NOS的基因表达异常，EH患者存在NO生成缺陷，见有血管舒张功能障碍[4]。近期研究显示，高血压患者血管内皮NO功能失调不仅与NO合成减少有关，还与NO被超氧阴离子破坏过多有关[5]。高血压患者的中性粒细胞及单核细胞内的氧自由基活性增强，抗氧化酶活性减弱。SOD，GSH-Px都是内源性抗氧化系统的重要抗氧化酶之一，可以有效地消除氧自由基，从而保护NO不受氧自由基的破坏，保持血管正常的舒缩活性，而MDA的含量可有效反映体内脂质过氧化损伤和氧化应激的水平。本研究证实，与假手组比较，肾性高血压模型大鼠血清NO含量和血清SOD，GSH-Px活力明显降低(P<0.01)，血清MDA含量明显升高(P<0.01)，说明肾性高血压模型大鼠见有明显的氧化应激损伤和内皮功能失调的表现。但模型大鼠血清NOS和iNOS含量升高，可能是由于NO降解导致NOS和iNOS活性代偿性升高，也间接说明模型大鼠NO含量降低可能是由于体内超氧阴离子破坏过多导致，这还需要进一步实验证明。本研究显示，天钩方能够明显升高血清NO含量和血清SOD、GSH-Px活力(P<0.01)，降低血清MDA含量(P<0.01)，并可呈现一定的剂量依赖关系，从而说明，抗氧化、保护血管内皮功能是天钩方治疗高血压的作用机制之一。
       【参考文献】
         　　[1] 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学，第3版[M].北京：人民卫生出版社，2004.
       
       [2] 戴 勇，彭武建，徐卓佳. “两肾一夹”肾性高血压大鼠模型的改进[J]. 实验动物科学与管理,2003，23(2):60.
       
       [3] Thomas GD，Zhang W ，Victor RG. Nitric oxide deficiency as a cause of clinical hypertension：promising new drug targets for refractory hypertension[J].JAMA，2001，285：2055.
       
       [4] Leclercq B，Jaimes EA，R L. Nitric oxide synthase and hypertension[J].CurtOpin NephrolHypertens，2002，11：185.
       
       [5] Calo LA.Davis PA.Pagnin E，et a1. NADPH oxidase，superoxide overproduction and nitric oxide bioavailability in essential hypertension[J].J Hypert，2005，23：665.