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       【摘要】 
       目的探讨六味地黄颗粒对哮喘大鼠炎症介质白三烯β4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)及5脂氧合酶(5-LO)含量的影响。方法将SFP级SD大鼠160只随机分为8组，每组20只。除空白对照组和生理盐水组外，其余各组均以卵蛋白(OVA)辅以氢氧化铝凝胶为佐剂注射致敏，2周后雾化吸入2%OVA激发哮喘，建立哮喘模型，从实验第8天，各组分别用药干预，生理盐水组用生理盐水腹腔注射及吸入代替，空白对照组不予处理，造模时间共28d，取材后，高倍镜下观察各组大鼠肺及支气管的病理学改变;采用ELISA法检测肺组织匀浆中LTB4、LTC4的浓度。对大鼠肺组织中5-LO含量进行免疫组化评估。结果六味地黄颗粒组、六味地黄颗粒辅助地塞米松组、六味地黄颗粒辅助布地奈德组肺组织中LTB4、LTC4的浓度明显低于哮喘模型组(P<0.05)。各用药组肺组织中5-LO含量与哮喘模型组比较并无明显差异(P>0.05)。结论六味地黄颗粒在治疗哮喘过程中可能抑制肺组织中LTB4、LTC4 分泌，这可能是其治疗哮喘的作用靶点之一。
       【关键词】  六味地黄颗粒; 炎症介质白三烯β4; 白三烯C4; 5脂氧合酶; 哮喘
       支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分(cellular elements)参与的气道慢性炎症性疾病[1]。近年来其患病率在全球范围内有逐年增加的趋势。中医学运用补肾法治疗哮喘已经积累了丰富的临床经验， 笔者选择中医儿科古方六味地黄丸颗粒剂配合气道吸入糖皮质激素，观察其对哮喘大鼠肺组织中炎症介质白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)及5-脂氧合酶(5-LO)的影响，探讨六味地黄颗粒及辅助糖皮质激素对参与哮喘慢性炎症过程中相关炎性介质的影响。
       1 材料与仪器
       1.1 动物选用SPF级SD大鼠160只，4～6周龄，雄性，体质量(150±20)g ，上海斯莱克动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005。
       1.2 药物六味地黄颗粒的组成：根据钱乙《小儿药证直诀》中六味地黄丸的组方，即熟地黄、山萸肉、干山药、泽泻、牡丹皮、白茯苓，按8∶4∶4∶3∶3∶3比例制成免煎中药饮片颗粒剂，每包含生药10 g，由江阴天江药业有限公司生产(批号：0903027)，温开水调制每毫升含生药1 g。地塞米松注射液，400 mg/L，由郑州羚锐制药股份有限公司生产(批号：0807292);吸入用布地奈德混悬液，1 mg/2ml，由广西医药公司提供(批号：305551)。
       1.3 试剂与仪器卵清蛋白，由恒因生物有限公司提供(批号：0907232);氢氧化铝凝胶分析纯，由天津市博迪化工有限公司提供(批号：20080603);LTB4试剂盒、LTC4试剂盒，由大连泛帮生物有限公司提供(批号：70621S);5-LO免疫组化染色试剂盒，上海晶天生物有限公司提供;生理盐水若干。压缩雾化吸入机， 德国百瑞有限公司生产(型号：ARI-1205);自动化酶免分析仪，北京石天医疗制作所生产(型号：SM-3 );显微镜;离心机;16L密闭整理箱等。
       2 方法
       2.1 动物分组及处理将大鼠按体质量(非被试因素)分为4层，然后在分层基础上按随机数字表法随机分为8组，每组20只。分别为六味地黄颗粒组(A组)，六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)，地塞米松组(C组)，六味地黄颗粒辅助布地奈德组(D组)，布地奈德组(E组)，哮喘模型组(F组)，生理盐水组(G组)、空白对照组(H组)。
       参照迟磊等[2]使用的方法，并稍加改进复制大鼠哮喘模型，方法如下：除G、H组外，各组分别于第1天、第8天用新鲜配制的卵蛋白(OVA100 mg)辅以氢氧化铝佐剂200 mg及生理盐水l ml混悬液在大鼠两腹股沟、后足跖，共4点做皮下注射，每点0.2 ml、同时腹腔注射0.2 ml。G组以腹腔注射生理盐水代替;于实验第8天即第2次致敏的同一天开始，A组、B组及D组大鼠胃饲六味地黄颗粒剂20 g/(kg·d)，C组、E组、F组及G组大鼠均胃饲等量生理盐水，第15～28天每天喂药后除G、H组外分组将致敏的大鼠置于密闭容器内用超声雾化器雾化吸入2%OVA生理盐水悬液，30 min/d，进行激发。同时每次激发前1 h,B组及C组分别预先吸入400 mg/L地塞米松20 min，D组及E组分别吸入1 mg/3 ml布地奈德混悬液15 min，A组、F组及G组以雾化吸入生理盐水代替，方法同上。H组不做任何处理，各组除施加以上药物因素处理外其日常饲养方法均相同。可以自由进食常规饲料和水。第29天处死大鼠。
       2.2 标本采集及指标检测
       2.2.1 标本的采集及肺组织病理学观察从实验大鼠中每组随机抽取10只，最后一次激发后12 h，20%乌拉坦5 ml/kg麻醉下处死。放血后打开胸腔取右肺部分组织，10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，观察气道及肺组织病理学改变。
       观察方法：观察切片至少5个具有代表性的高倍视野，以每个视野中气道上皮细胞脱落及肺组织炎症细胞所占的比例，可得出气道上皮细胞和肺组织的炎症程度，观察结果：以“±”表示和文字描述。每个视野中气道脱落的上皮细胞及肺组织炎症细胞所占比例小于15%为正常范围，用“-”表示;16%～30%为轻度，用“+”表示;31%～60%为中度，用“++”表示，大于60%为重度，用“+++”表示。
       2.2.2 白三烯β4、白三烯C4的测定取肺组织100 mg，加入磷酸盐缓冲液1.5 ml，内切式组织匀浆机匀浆，1 500 r/min离心10 min，上清液采用双抗夹心酶联免疫吸附实验(sandwich ELISA)检测肺组织匀浆液中TLB4、TLC4的含量，实验过程参照试剂说明书进行， 自动酶标仪测定每孔的光密度(OD)，并根据标准曲线求得所测样品浓度。
       2.2.3 5-脂氧合酶的免疫组化检测取大鼠左肺一叶，10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，固定36 h，使用免疫组化染色试剂盒进行免疫组化及染色，严格按照说明书进行操作，每一批免疫组化均设有用磷酸盐缓冲液代替一抗的阴性对照。采用盲法进行免疫组化评估，观察切片至少5个具有代表性高倍视野，不少于1 000个细胞，对免疫组化结果进行评估。结果的判定采用记分法，根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅记分。阳性细胞比例30%以下为1分，30%～60%为2分，60%以上为3分;细胞无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分。根据二者乘积判断阳性等级：0分为阴性“-”，1～3分为弱阳性“+”，4～6分为阳性“++”，大于6分为强阳性“+++”。
       2.3 统计学分析在计算机上建立数据库，通过SPSS17.0软件进行统计学处理，各组间比较用秩和检验及方差分析F检验。以P<0.05判定结果有无显著性差异。
       3 结果
       3.1 各组大鼠造模过程中表现及行为学评价观察发现哮喘模型组(F组)大鼠进行激发前(第14天)出现明显的过敏反应(明显的头部瘙痒、烦躁)，激发一周后(第21天)逐渐出现喷嚏、前肢缩抬、呼吸加快或安静少动，激发到两周后(第28天)大鼠出现节律性收腹样喘促，甚至喘促至死。六味地黄颗粒组(A组)及其他各组与哮喘模型组比较，过敏反应轻微，稍有呼吸改变，未见明显喘促。但是六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)及地塞米松组(C组)与其他各组相比，体质量明显减轻。空白对照组(H组)大鼠正常成长，未见异常表现。参考文献方法[3]，建立评分标准并对各组实验大鼠在造模过程中的行为学表现进行评分。见表1。表1 各组大鼠造模过程中的行为学评分结果
       3.2 肺组织病理学改变 哮喘模型组大鼠的肺组织HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落，支气管平滑肌收缩，管腔狭窄，支气管壁及管腔内有大量炎症细胞浸润。六味地黄颗粒治疗组病理学改变轻微，生理盐水组大鼠支气管上皮细胞有不同程度的脱落，肺组织炎症细胞明显。空白对照组大鼠的支气管肺组织未见明显改变。见图1。　图1 各组实验动物肺组织病理学变化
       3.3 各组大鼠气道上皮细胞脱落及炎症细胞浸润程度 结果见表2。高倍镜下观察气道上皮细胞脱落情况可见：各处理组间气道上皮细胞脱落程度有差异(H=35.217,P=0.000);哮喘模型组(F组)的HE染色切片中气道上皮细胞脱落程度较重，与空白对照组(H组)比较，具有显著差异(P<0.01);六味地黄颗粒组(A组)、六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)、地塞米松组(C组)、六味地黄颗粒辅助布地奈德组(D组)、布地奈德组(E组)脱落程度较哮喘模型组明显减低，差异也具有显著性(P<0.05)。
       高倍镜下观察肺组织炎症细胞浸润情况可见:各处理组间炎症细胞浸润程度不同(H=37.404，P=0.000)。哮喘模型组(F组)的肺组织HE染色切片中炎症细胞浸润程度明显较重，与空白对照组(H组)相比，差异具有显著性(P<0.01);六味地黄颗粒组(A组)、六味地黄颗粒辅助地塞米松组(B组)、地塞米松组(C组)、布地奈德组(E组)的炎症细胞浸润程度明显低于哮喘模型(P<0.01);六味地黄颗粒辅助布地奈德组(D组)与哮喘模型比较差异没有统计学意义(P>0.05)。表2 各组大鼠肺组织HE染色切片结果比较
       3.4 各组大鼠肺组织中TLB4、TLC4含量变化 用双抗夹心酶联免疫吸附试验(sandwich ELISA)检测检测肺组织匀浆液中TLB4、TLC4的含量，实验过程参照试剂说明书进行， 自动酶标仪测定每孔的光密度(OD值)，并根据标准曲线求得所测样品浓度(pg/ml)。结果见表3。六味地黄颗粒组、六味地黄颗粒辅助地塞米松组、六味地黄颗粒辅助布地奈德组大鼠肺组织中TLB4、TLC4含量明显低于哮喘模型组,差异有统计学意义(P<0.05);与哮喘模型组比较，地塞米松组大鼠肺组织匀浆液中TLC4的含量明显减低，而TLB4的含量差异不明显;而布地奈德组与哮喘模型组比较，TLB4、TLC4含量减低都不明显，没有统计学意义(P>0.05)。表3 各组大鼠肺组织中TLC4和TLB4的含量(±s)pg·ml-1
       3.5 各组大鼠肺组织中5-LO的免疫组化结果 应用免疫组化染色试剂盒进行免疫组化及染色，严格按照说明书进行操作，每一批免疫组化均设有用磷酸盐缓冲液代替一抗的阴性对照，采用盲法进行免疫组化评估。评估结果采用秩和检验进行统计分析。结果见图2，表4。从结果可见：各组大鼠肺组织中5-LO含量免疫组化结果差异不明显，没有统计学意义(H=7.090，P=0.313)。与哮喘模型组比较，六味地黄颗粒治疗组肺组织中5-LO进行免疫组化染色后，高倍镜下见其阳性细胞比例及着色深浅差异不明显，差异没有统计学意义(P>0.05)。其他用药组与哮喘模型组比较也没有明显的差异(P>0.05)。图2 免疫组化法检测肺组织5-LO的表达表4 各组大鼠肺组织DAB染色切片中5-LO的免疫组化结果比较
       4 讨论
       支气管哮喘是一种以气道高反应性和可逆性气道阻塞为特点的慢性炎症性疾病。近年来哮喘的患病率和病死率呈不断上升趋势，尤其是儿童哮喘，已成为儿童最常见的慢性呼吸道疾病[4]。近年来研究发现，哮喘患者的气道炎症是各种炎性介质与气道内各种炎性细胞共同作用的结果，CysLTs是参与气道炎症与重塑的重要介质，已成为了研究哮喘发病和药物治疗的重要指标之一。糖皮质激素是目前最有效的抗气道炎症药物，但不能抑制所有参与哮喘发病过程的细胞因子和炎症介质，哮喘患者经过规范和长期ICS治疗后，尽管其气道炎症明显减轻，但仍持续存在。大量研究显示，全身用或吸入糖皮质激素均不能有效抑制体内LTs合成与释放[5]。而且由于长期应用激素的副作用使患儿及家长对激素的依从性较差，陈贵华等[6]对138例哮喘患者的调查研究中发现：哮喘患者ICs使用率较低，仅为13% (18/138)。其未持续使用ICs的主要因素是担心激素不良反应的占68.3% (82/138)，这直接影响了哮喘的治疗效果。
       中医学在治疗小儿哮喘方面注重缓解期的调治，认为哮喘的发病多源于患儿的肺、脾、肾三脏功能不足，哮喘患儿由于长期使用糖皮质激素，常表现有面红、多毛、多汗、多语、舌红、脉数等“阴虚”征象。六味地黄丸(颗粒)出自我国宋代著名中医儿科医家钱乙的《小儿药证直诀》，是滋阴补肾代表方剂，为治疗肾阴虚证之要方。近十几年来对其药理研究颇多，发现其对支气管哮喘的防治作用颇佳。有研究表明，在长期使用糖皮质激素的同时加用该方可防止激素单独使用时所出现的副作用[7]。 笔者临床上针对哮喘患儿的体质特点，在哮喘缓解期选用具有滋阴补肾作用的六味地黄颗粒进行治疗，取得了良好的效果，但是其作用靶点并不明确，所以笔者通过研究六味地黄颗粒及辅助糖皮质激素对哮喘大鼠肺组织中TLB4、TLC4及5-LO的影响，探讨其在治疗哮喘中的作用靶点。
       本实验选用SD大鼠，参照迟磊等[2]使用的造模方法，并稍加改进复制大鼠哮喘模型，经致敏原激发后，哮喘模型组大鼠支气管肺病理切片中特异性的致敏原诱发的炎症和组织损伤如气道壁上皮细胞脱落、结构破坏、炎性细胞浸润等改变显著，表现出明显的气道炎症。而六味地黄颗粒及辅助糖皮质激素治疗的各组大鼠支气管肺病理切片中气道壁炎症细胞浸润、上皮水肿脱落等程度轻微，说明六味地黄颗粒确实可以改善哮喘的组织病理变化。结果提示：在哮喘缓解期用气道吸入糖皮质激素治疗的同时加用六味地黄颗粒可更加有效地抑制哮喘气道炎症。而作为生理盐水对照组，实验过程利用生理盐水代替卵清蛋白对大鼠进行激发，从实验结果看，并不理想，该组大鼠肺组织病理切片显示大鼠气道有不同程度的炎症及上皮细胞脱落。对哮喘大鼠肺组织中TLB4、TLC4及5-LO研究结果表明：六味地黄颗粒对哮喘大鼠肺组织中TLB4、TLC4的分泌具有抑制作用，这可能就是六味地黄颗粒在哮喘治疗中的作用机制之一。
       【参考文献】
         　[1] 中华医学会呼吸疾病学分会哮喘组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2008,31(3):177.
       
       [2] 迟 磊，符 州，戴继宏，等.过敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重庆医学,2003,32(4):429.
       
       [3] 徐 立，纪蕾蕾，范欣生，等.三拗汤及类方对卵蛋白致敏豚鼠哮喘模型引喘潜伏期及其EOS的影响[J].南京中医药大学学报，2008，24(6):391.
       
       [4] 全国儿科哮喘协作组.2000年与1990年儿童支气管哮喘患病率的调查比较[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27(2)：112.
       
       [5] Graeme PC，Daniel KC，Kay h，et a1.Effects of montelukast on surrogate inflammatory markers in corticosteroid — treated patients with asthma[J].Am J Respir Crit Care Med，2003，16(7)：1232.
       
       [6] 陈贵华，李代先，周丽华.哮喘患者使用吸入激素的依从性调查及对策[J].重庆医学,2009,38(17 )：2213.
       
       [7] 马以泉.六味地黄丸对肾病综合征患儿外周血精皮质激素受体水平的影响[J].浙江中医学院学报，2000，24(3)：49.