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       【摘要】 
       目的探讨P38MAPK信号转导通路在β-榄香烯诱导人胃癌BAC823细胞凋亡过程中调控作用。方法人胃癌BAC823细胞体外传代培养，按空白对照组和药物处理组随机分组，其中药物处理组依药物浓度的不同再分为0.01，0.02，0.04，0.08 mg/ml，0.10及0.16 mg/ml处理组，作用时间为24h，采用流式细胞光度分析术(FCM)检测细胞凋亡率及细胞周期时相分布，同时进行细胞的形态学观察;采用免疫组化法检测P-P38MAPK的表达。结果β-榄香烯可阻滞BAC823细胞于S期并诱导细胞凋亡，但细胞凋亡率并不完全与药物浓度呈正相关。P38MAPK的活化水平随药物浓度的增加而增强。结论β-榄香烯可激活P38MAPK通路，而且此通路也很可能参与了β-榄香烯阻滞细胞周期诱导肿瘤细胞凋亡的过程。
       【关键词】  β-榄香烯; 人胃癌BAC823细胞; 细胞凋亡; P38MAPK
       Effect of β-elemene on Apoptosis and P-P38MAPK of Human Gastric Cancer BAC823 Cells
       WANG Xiaoxiao1,
       QU Yanhui2
       (1.The First Affiliated Hospital of TCM College of Henan, Zhengzhou，450000;2.TCM College of Hunan，Changsha，410007,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of β-elemene on signal transduction pathway P38MAPK during apoptosis of cancer cells.
       MethodsHuman gastric cancer BAC823 cells were cultured in vitro .The cells were divided into two groups including blank control group and drug groups.In terms of concentration, drug groups were divided into 0.01，0.02，0.04，0.08,0.10,and 0.16 mg/ml groups.The effective time was 24h . Apoptotic rate and fraction of the cell cycle phase were measured with flow cytometry(FCM).At the same time,morphological and adhesive changes of the cells were observed under an inverted microscope. The level of P-P38MAPK was measured with immunocytochemical method.
       Results1.The result of FCM examination and morphological observation showed that β-elemene could inhibit BAC823 cells at S phase and induce apoptosis.But between the rate of apoptosis and the drug concentration ,there was linear correlationship. 2. The result of SABC showed that the level of P-P38MAPK was enhanced while the drug concentration increased.
       Conclusionβ-elemene can activate P38MAPK pathway and the pathway probably takes part in regulating the apoptotic process .
       Key words：β-elemene; Human gastric cancer BAC823 cells; Apoptosis ; P38MAPK
       β-榄香烯是从活血化淤中药温莪术挥发油中提取的一种抗癌有效成分，经药理学试验表明，其抗癌作用疗效确切、毒副作用小、抗瘤谱广,具有广阔的应用前景[1]。现已证实诱导肿瘤细胞凋亡是β-榄香烯抗癌作用机理的重要方面之一[2]。本实验通过检测β-榄香烯对胃癌BAC823细胞凋亡的影响及BAC823细胞在β-榄香烯作用下细胞信号转导因子P38MAPK的磷酸化即其活化水平，初步探讨P38MAPK信号通路在β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡过程中的调控作用。
       1 材料与仪器
       1.1 药物β-榄香烯，从温莪术挥发油中提取，由大连金港制药厂提供，经湖南中医药大学药学院药化实验室鉴定纯度为99.8%。
       1.2 细胞株人胃癌BAC823细胞株，引自中南大学湘雅医学院细胞实验中心。
       1.3 试剂 Hanks液(武汉博士得生物工程有限公司);0.25%胰蛋白酶(美国DIFCO公司);RPMI1640(美国GIBCO公司);小牛血清(杭州四季生物制品有限公司);4%多聚甲醛(武汉博士得生物工程有限公司);多聚赖氨酸粘片剂(北京中杉生物技术有限公司);PBS平衡液(武汉博士得生物工程有限公司);P-P38MAPK抗体(200μg/ml,北京中杉生物技术有限公司);SABC试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司);DAB显色试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司)。
       1.4 仪器净化工作台(SW-CJ-IF，苏州净化设备厂);CO2培养箱(CJ-1088型，长沙长锦应用技术研究所);生物倒置显微镜(XSB-1A，广西梧州光学仪器厂);高速冷冻离心机(TGL16M，长沙科威实业有限公司);流式细胞仪(EPICSXI，美国COULTER公司);图像分析软件(Optimas 6.5, 美国) 等。
       2 方法
       2.1 细胞培养在37℃，100%相对湿度，5%CO2，95%空气的培养箱中，用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH值为7.2的RPMI-1640完全培养液体外传代培养。
       2.2 分组整个实验过程分批进行，每批细胞按所要检测的指标随机分为药物处理组和空白对照组，其中药物处理组设6个浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.10，0.16 mg/ml，作用时间为24 h。
       2.3 指标检测
       2.3.1 人胃癌BAC823细胞凋亡的形态学观察取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液制备成浓度为5.0×104/ml的细胞悬液，然后平均分配至各细胞培养瓶中，并随机分为7组，预培养24 h;临用前，将β-榄香烯用RPMI1640培养液稀释，稀释终浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.10，0.16 mg/ml;取出细胞培养瓶，弃去培养液，用Hanks液洗3次后，按照分组，分别加入等量不同浓度的β-榄香烯稀释液，其中一组为空白对照组即不含药物组;放入培养箱中继续培养24 h。24 h后将细胞培养瓶置于倒置显微镜下进行观察,比较不同浓度药物处理组及空白对照组细胞形态、大小及细胞群体生长情况的不同,照相并记录实验结果。
       2.3.2 细胞凋亡率及细胞阻滞周期的检测采用流式细胞光度分析术(FCM)。1 000 r/min离心5 min收集以上各组处理后细胞，每个样本含细胞至少1.0×106;于各离心管中加入预冷0℃70%乙醇溶液，并用吸管吹打均匀，固定18 h以上;离心后去固定液，再加入PBS液重悬5 min,400目筛网过滤1次，500～1 000 r/min离心5 min后去PBS,用1 ml PI染液闭光染色30 min;上机检测。
       2.3.3 人胃癌BAC823细胞P-P38MAPK的表达采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶技术(SABC技术)。
       标本制作：①制备细胞爬片：将经处理的无菌盖玻片置于6孔细胞培养板底部，取对数生长期细胞，经漂洗、消化后，用RPMI1640培养液制备成浓度为5.0×104/ml的细胞悬液，滴加细胞悬液于盖玻片上，预培养24 h;②加药：取出细胞培养板，弃去培养液，小心漂洗后，滴加稀释终浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.10，0.16 mg/ml的β-榄香烯稀释液，每孔设3个复孔，放入培养箱中继续培养24 h;③固定：取出盖玻片，弃去培养液，Hanks液漂洗后，滴加4%多聚甲醛固定液适量,同时加入少许10 mg/ml多聚赖氨酸以增加细胞黏附性，完毕，放入4℃冰箱保存备用。
       免疫细胞化学染色：①漂洗：取出盖玻片，弃去固定液，晾干后用蒸馏水漂洗3次;②灭活内源性过氧化物酶：用30%H2O2与纯甲醇(1∶50)的混合液在室温下将盖玻片浸泡30min;③漂洗：弃去H2O2与纯甲醇的混合液，再次用蒸馏水将盖玻片漂洗3次;④封闭：滴加5%BSA封闭液于盖玻片细胞面，室温放置20 min;⑤加一抗：去封闭液，不洗，用移液器加一抗稀释液(P-P38MAPK抗体，1∶100稀释度)于盖玻片细胞面，放入4℃冰箱过夜;⑥漂洗：去一抗稀释液，用PBS液洗2 min×3次;⑦加二抗：滴加二抗稀释液(生物素化山羊抗小鼠IgM)于盖玻片细胞面，室温放置20 min;⑧漂洗：去二抗稀释液，用PBS液洗2 min×3次;⑨加SABC：滴加试剂SABC(链酶亲和素-过氧化物酶复合物)于盖玻片细胞面，室温放置20 min;⑩漂洗：去试剂SABC，用PBS液洗5 min×4次;显色：室温下，将盖玻片细胞面浸入DAB显色剂，镜下控制反应时间;漂洗：显色适度时，去DAB显色剂，用蒸馏水洗涤;复染、制片：用苏木素轻度复染后，经脱水，透明，最后封片。
       显微摄像及图像分析:将所制玻片放于显微摄像系统，摄像并随机选取5个低倍镜视野，经电脑图象分析系统进行细胞灰度分析。
       2.4 统计方法实验数据用±s表示，运用SPSS12.0统计软件，采用F检验。
       3 结果
       3.1 β-榄香烯对BAC823细胞凋亡的影响
       3.1.1 细胞形态学观察结果结果显示，随药物浓度的增加，细胞生长密度逐渐下降，正常的多边形细胞形态中异形细胞逐渐增多。与空白对照组细胞相比，在0.01 mg/ml的药物浓度作用下，细胞变化不明显;在0.04 mg/ml的药物浓度作用下，则可见体积缩小、胞核固缩的圆形细胞即凋亡细胞明显增多;在0.08 mg/ml的药物浓度作用下除了以上明显变化外，尚可见许多散在膨大，染色质疏松的不规则形细胞即坏死细胞，有些甚至已发生胞膜破裂，且细胞生长受抑情况明显可见;在0.10 mg/ml的药物浓度作用下，上述表现更加明显;在0.16 mg/ml的药物浓度作用下，则可见大量细胞从瓶壁脱落形成细胞碎片，细胞形态大小不一，正常的细胞形态几乎不曾观察到，大多为圆形固缩细胞或不规则形膨大细胞。
       3.1.2 FCM检测结果见表1。表1 β-榄香烯对BAC823细胞凋亡及细胞周期时相的影响
       3.2 β-榄香烯对BAC823细胞P38MAPK磷酸化的影响人胃癌BAC823细胞在β-榄香烯作用24 h后，经SABC免疫细胞化学染色，显微观察结果可见，P-P38MAPK蛋白表达主要定位于细胞胞质，染色为棕褐色，且随药物浓度的增加，阳性细胞(着色者为阳性，不着色者为阴性)数明显增多，染色程度亦有所加深，0.16 mg/ml药物浓度组显示几乎所有细胞均被浓染。采用图像分析系统测定阳性细胞灰度，对P-P38MAPK进行半定量分析。结果见表2。表2 β-榄香烯对BAC823细胞P-P38MAPK表达的影响
       4 讨论
       诱导肿瘤细胞凋亡是β-榄香烯抗瘤作用机制的重要方面之一，这也是其不同于其他细胞毒类药物的重要原因。本实验结果显示，β-榄香烯可阻滞胃癌BAC823细胞从S期进入G2/M期并诱导细胞发生凋亡;在作用时间一定的情况下，β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡的作用并不与药物浓度成简单的直线相关关系，作用时间为24 h时，药物发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的最佳浓度应该在0.04～0.08 mg/ml之间，超过此浓度，药物对癌细胞的直接杀伤作用将转为其体外抗癌的主导因素，使细胞坏死现象增多，而诱导细胞自发性死亡减少。
       丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-actwated protein kinases,MAPKs)级联是细胞内重要的信号转导系统，细胞运用这一系统可将胞外刺激信号传递给胞核，从而参与细胞增殖、分化、转化及凋亡等一系列生理、病理过程。P38MAPK通路是MAPKs级联系统中的重要一支，其表达和活性的变化可有效调节和阻断关键的信号通路，调节细胞凋亡[3，4]。本实验采用免疫组化法检测了不同浓度β-榄香烯作用下，胃癌BAC823细胞内P-P38MAPK的表达情况。实验结果显示，各药物处理组P-P38MAPK的表达均强于空白对照组(P<0.01)。且随药物浓度的增加，P-P38MAPK的表达亦增强。由P38MAPK的活化情况说明β-榄香烯在作用于BAC823细胞时可激活胞内的P38MAPK通路，且此激活作用随药物浓度的增加而增强。由此我们推测β-榄香烯在诱导肿瘤细胞凋亡的过程，很可能与P38MAPK通路的参与有关。但P38MAPK通路在β-榄香烯诱导肿瘤细胞BAC823凋亡的过程中是否确实起到了促凋亡调控作用，对其他MAPK通路的影响如何，P38MAPK通路与β-榄香烯的抗耐药性间有的有没有关系，对细胞凋亡与细胞阻滞周期是否同时起作用等问题还有待于进一步深入的研究与证实。
       【参考文献】
         　[1] 花文峰，蔡绍晖.β-榄香烯抗肿瘤作用的基础与临床研究[J].中药材，2006，29(1)：93.
       
       [2] 邹丽娟，李 杰，于丽敏，等. β-榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡的研究[J].大连医科大学学报，1998，20(2)：9.
       
       [3] 章必成，杜光祖. P38MAPK在细胞凋亡中的作用[J].华南国防医学杂志，2002,16(1):22.
       
       [4] 梁先敏，杨克敌.Caspase和JNK/SAPK、P38MAPK与细胞凋亡[J].国外医学·卫生学分册，2008,35(1):5.