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       【摘要】 
       目的建立HPLC法测定云南不同产地滇龙胆中龙胆苦苷的方法。方法色谱柱为Waters Sunfire RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，流动相为甲醇-水溶液(20∶80)，柱温35℃，体积流量1.0 ml/min，检测波长270 nm。结果龙胆苦苷在0.077 4 ～ 1.160 4 mg(r = 0.999 8)线性关系良好，平均回收率为98.8%(RSD = 1.86%，n = 9)，检测10批样品其龙胆苦苷的含量在2.75% ～4.87%之间。结论该方法简便快速、准确，可为评价滇龙胆药材质量提供依据。
       【关键词】  高效液相色谱法; 滇龙胆; 龙胆苦苷
       Determination of Gentiopicroside in the Plant of Gentiana rigescens from Different Regions in Yunnan Province by HPLC
       LAI Guofang1,2,
       CHENG Bin2,
       LUO Shide1,
       WANG Yifen1*
       (1.Yunnan Institute for Food and Drugs Control, Kunming 650011,China; 2.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the method of the gentiopicroside in the plant of Gentiana rigescens from different regions in Yunnan province by HPLC.
       MethodsThe Watres Sunfire C18(4.6mm×250mm, 5μm)was used, with mixture liquid of methanol and water(20:80)as mobile phase. The detection wavelength was 270 nm, the column temperature was 35℃, and the flow rate was 1.0ml/min.
       ResultsGentiopicroside showed a good linear relationship within the range of 0.0774 ～ 1.1604 mg(r = 0.9998), the recovery rate was 98.8%, and RSD was 1.86% (n = 9). The gentiopicroside content of Gentiana rigescens in 10 different regions was within the range of 2.75%～4.87%.
       ConclusionThe method is simple and accurate，and can be used to identify and evaluate the quality of Gentiana rigescens.
       Key words：HPLC; Gentiana rigescen; Gentiopicroside
       龙胆为常用中药，《中国药典》收载龙胆Gentiana scabra Bge.，条叶龙胆G. manshurica Kitag.，三花龙胆G. triflora Pal1.或坚龙胆G. rigescens Franch.的干燥根及根茎，前3种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。坚龙胆主产云南又称为滇龙胆。滇龙胆含多种化学成分，如环烯醚萜类，生物碱类，挥发油类等，其中环烯醚萜类是其特征性成分，其功效有清肝火、除湿热、健胃等[1]。为充分利用云南丰富的龙胆药材资源，本实验以龙胆苦苷为指标成分，采用HPLC法测定了采自云南不同地区的10份滇龙胆样品，为评价滇龙胆药材质量提供一定的科学依据。
       1 材料
       1.1 样品来源实验所用滇龙胆样品，经中国科学院昆明植物研究所罗士德研究员鉴定，为龙胆科滇龙胆G. rigescens Franch.的干燥根及根茎，其植物标本存放于中国科学院昆明植物研究所。
       1.2 仪器与试药 美国Waters 2695高效液相色谱仪及其配套工作站，DAD检测器检测，甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，水为二次蒸馏水，0.45 μm针式微孔滤膜，其他试剂均为分析纯，龙胆苦苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110770-200510，供含量测定用。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Waters Sunfire RP18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相为甲醇-水溶液(20∶80)，柱温35℃，体积流量1.0 ml/min，检测波长270 nm。
       2.2 对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷对照品9.67 mg置入25 ml 容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，即得。
       2.3 供试品溶液的制备取滇龙胆干燥的根粉碎后过4号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率20 kHz)15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。
       2.4 线性关系考察精密吸取龙胆苦苷对照品溶液2，5，10，15，20，30 μl注入液相色谱仪进行测定。以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行回归处理，得到龙胆苦苷回归方程为：Y= 12 887 230X – 147 037.8(r = 0.999 8)，线性范围为0.077 4 ～ 1.160 4 mg/ml。见图1～2。图1 龙胆苦苷对照品图2 滇龙胆样品
       2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl，连续进样5次，测定龙胆苦苷峰面积，结果其RSD为1.40%，表明仪器的精密度良好。
       2.6 重复性实验取同一样品，按“2.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液，进行测定，计算龙胆苦苷质量分数，RSD为1.36%，表明该条件重复性良好。
       2.7 稳定性实验将同一样品已制备好的供试品溶液在室温下放置0，2，4，6，8，10 h后分别进样10 μl进行测定，计算龙胆苦苷质量分数，RSD为1.43%，表明在本实验条件下供试品溶液在室温下放置10 h内基本稳定。
       2.8 回收率实验取云南(通海)滇龙胆样品粉末9份各约0.25 g，精密称定，分别按其质量分数的80%，100%，120%精密加入龙胆苦苷对照品适量，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，进行测定，计算加样回收率，结果平均加样回收率为98.8%，RSD为1.86%，表明本法回收率较好。
       2.9 样品测定取云南10个不同地域的滇龙胆样品的根，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，进行测定，以外标法计算龙胆苦苷的质量分数。结果见表1。表1 云南不同地域滇龙胆中龙胆苦苷的测定结果
       3 讨论
       3.1 提取条件的考察以龙胆苦苷为指标，采用正交实验考察了药材粒度、提取溶剂、溶剂用量、提取方法等因素对实验结果的影响，结果表明提取溶剂、加热回流对试验结果有显著影响，其余因素影响甚微，优选出的最佳提取条件为药材粉碎成中粉，加50倍量的甲醇超声处理15 min。
       3.2 检测波长的选择参考《中国药典》2005年版Ⅰ部龙胆药材含量测定项下的检测波长为270 nm，故本实验检测波长仍选用270 nm。
       3.3 流动相的考察根据文献报道[2～4]，目前测定龙胆苦苷是HPLC方法，所采用流动相系统有甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.4%磷酸溶液等，再根据具体的仪器及色谱柱调节流动相比例，本实验参照《中国药典》2005年版Ⅰ部龙胆药材含量测定项下流动相系统，即：甲醇-水，并在此基础上进行适当调节，最终选择甲醇-水(20∶80)。
       【参考文献】
         　[1] 吴征镒，周太炎，肖培根，等.新华本草纲要，第2册[M].上海：上海科学技术出版社，1991：392.
       
       [2] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：64.
       
       [3] 吴志平，张发成，毛志英.HPLC法测定骨刺消痛胶囊中龙胆苦苷的含量[J].药学与临床研究,2008，16(5)：408.
       
       [4] 俞桂新， 王峥涛，董婷霞，等. 龙胆药材中龙胆苦苷的含量测定[J].上海中医药杂志，2005，39(11)：53.