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       【摘要】 
       目的建立枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法采用毛细管区带电泳，高频电导检测;未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 μm ID，有效长度46 cm;1.2 mmol·L-1三乙胺-HCl(pH=10.60)，0.24 mmol·L-1β-环糊精为运行缓冲液;分离电压12.5 kV;重力进样10 s(高度20 cm)。结果以布洛芬为内标，齐墩果酸、熊果酸线性范围分别为5.1～102.0 g/ml(r=0.999 7)和5.55～111.0 g/ml(r=0.999 3);平均回收率分别为96.0%和97.2%。结论该法简便、准确、快速、重现性好，可用于枇杷叶的质量控制研究。
       【关键词】  毛细管电泳; 高频电导检测; 枇杷叶; 齐墩果酸; 熊果酸
       Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid Isomers in Folium eriobotryae by Capillary Zone Electrophoresis with High Frequency Conductivity Detection
       ZHANG Feng1，
       SONG Fenyun2*
       (1.Hospital of Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi 030801 ,China;
       2.Guangdong Pharmacological University，Guangzhou 510224，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid isomers in Folium eriobotryae.
       MethodsIt was studied by Capillary Zone Electrophoresis with high frequency conductivity detection. The separation was performed on a uncoated fused silica capillary of 55 cm×75 μm ID(46 cm effective length). 1.2 mmol·L-1 Triethylamine(TEA) buffer containing 0.24 mmol·L-1 β-cyclodextrin and pH adjusted to10.60 with Hydrochloric acid was selected for the running buffer. The voltage applied was 12.5 kV and temperature was maintained at 25℃. The sample was injected by gravity(10 s，20 cm).
       ResultsThe linear ranges of determination for oleanolic acid and ursolic acid were 5.1～102.0 g/ml(r=0.9997) and 5.55～111.0 g/ml(r=0.999 3). The average recovery for oleanolic acid and ursolic acid was 96.0%,97.2% respectiviely.
       ConclusionThe method is reliable，simple，rapid and accurate. The method can be used for quantitative determination of oleanolic acid and ursolic acid isomers in Folium eriobotryae.
       Key words：Capillary Zone Electrophoresis; High frequency conductivity detection; Folium eriobotryae; Oleanolic acid; Ursolic acid
       枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl. 的干燥叶，有清肺止咳、降逆止呕之功效，主治肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴等症[1]，主产于广东、江苏、福建、江西等地。近年来对其化学成分的研究表明，其主要成分为三萜酸和倍半萜及其苷类，药理活性的报道也主要集中于三萜酸的抗炎、降血糖和抗病毒活性[2～4]方面。目前枇杷叶的含量测定方法有薄层色谱法[5]和HPLC法[6]。本文采用毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)高频电导(High frequency conductivity detection)检测的方法[7]，对不同产地枇杷叶中齐墩果酸(oleanolic acid，简称OA)和熊果酸(ursolic acid，简称UA)进行含量测定的研究，以期为药材质量控制提供可借鉴的依据。
       1 仪器与试药
       CES2003毛细管电泳仪，包括高压电源、高频电导检测器及毛细管电泳数据工作站(中山大学化学与化学工程学院研制)。ORION MODEL 828型pH计(美国)。DL-360超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)，工作频率4.5 kHz ± 5%，输出功率240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75m ID，河北锐年永沣色谱器件有限公司)。
       枇杷叶样品(批号1：购自广东清远;批号2：购自广东连山;批号3：购自河南;批号4：购自江苏;批号5：购自福建)，经广东药学院生药学专家房志坚副教授鉴定为真品。将其粉碎，于60℃下干燥4 h，置干燥器内备用。定量方法学考察采用广东清远的样品。
       齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742-200516);布洛芬对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100179-200303)。β-环糊精(中国医药集团上海化学试剂公司);三乙胺等试剂均为分析纯;水为去离子水(电阻为16.6MΩ·cm-1)。
       2 方法
       2.1 溶液的制备
       2.1.1 内标溶液精密称取布洛芬对照品20.2 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标贮备液(浓度为404 g/ml)。
       2.1.2 对照品溶液 精密称取OA对照品20.4 mg，UA对照品22.2 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度分别为408 g/ml和444 g/ml)。
       2.1.3 供试品溶液取本品粉末约2.0 g，精密称定，加甲醇40 ml，水浴中加热回流2 h，冷却至室温，转移至50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，续滤液0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。
       2.2 电泳条件未涂层弹性融硅石英毛细管柱50 cm×75 μm ID，有效长度46 cm;以1.2 mmol·L-1三乙胺-HCl(pH=10.60)，0.24 mmol·L-1 β-环糊精为运行缓冲液;分离电压12.5 kV;重力进样10 s(高度20 cm);温度25℃，湿度小于45%。毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗5 min;检测电极和缓冲液容器用超声波清洗10 min。进样5次之后也需按照上述步骤清洗毛细管。在此条件下，对照品、样品色谱图见图1。1.齐墩果酸 2.熊果酸3.布洛芬 4.水峰图1 对照品(A)、样品(B)的毛细管电泳色谱图
       2.3 方法学考察
       2.3.1 标准曲线制备 分别吸取一定量的对照品贮备液、内标溶液加甲醇稀释成含齐墩果酸浓度为5.1，10.2，20.4，40.8，61.2，81.6，102.0 g/ml、熊果酸浓度为5.55，11.1，22.2，44.4，66.6，88.8，111.0 g/ml与内标溶液浓度为20.1 g/ml的溶液。依次重力进样10s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度(C)为横坐标进行线性回归，分别得回归方程YOA =0.023 5C-0.026 7(r=0.999 7);YUA=0.022 9C-0.026 4(r=0.999 3)。表明OA浓度在5.1～102.0 g/ml、UA浓度在5.55～111.0 g/ml范围内与峰面积线性关系良好。
       2.3.2 精密度实验取浓度分别为40.8、44.4 g/ml的OA与UA对照品溶液，重力进样10 s，连续测定5次，记录峰面积并计算RSD。结果YOA的RSD =1.57%，YUA的RSD =1.35%，表明仪器精密度良好。
       2.3.3 稳定性实验取供试品溶液(批号1)在0，2，4，8，24 h，分别重力进样10 s，记录峰面积。结果YOA的RSD = 4.64%，YUA的RSD =3.50%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
       2.3.4 重复性实验取同一批号(批号1)样品6份，按“2.1.3”项下方法提取、测定。结果OA的平均含量为3.63 mg·g-1，RSD = 4.54%(n=6);UA的平均含量为9.08 mg·g-1，RSD = 3.88%(n = 6)。表明分析方法精密度良好。
       2.3.5 加样回收实验精密称取同一批号(批号1)的枇杷叶药材共6份，加入相应量的OA和UA对照品，按“2.1.3”项下方法处理并测定，计算回收率。OA的平均回收率为96.0%、RSD =2.76%;UA的平均回收率为97.2%，RSD = 3.44%。结果表明方法准确、可靠。结果见表1～2。表1 OA回收率实验结果　表2 UA回收率实验结果
       2.4 样品测定 取不同产地的枇杷叶，按“2.1.3”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。结果见表3。表3 枇杷叶样品中OA和UA的含量测定结果
       3 讨论
       3.1 缓冲液的选择实验考察了NaAc-HAc，三乙胺-H3BO3，Tris-H3BO3，NaH2PO4-H3PO4，Tris-Na2HPO4，NaH2PO4- Na2HPO4， 三乙胺-HCl等几种电解质体系不同浓度和不同配比对分离效果的影响。结果发现，只有在三乙胺-HCl和三乙胺-H3BO3这两个体系中OA和UA可以出峰。将这两个体系进行实验对比，三乙胺-HCl体系基线平稳，峰形较好，检测信号灵敏度高，因此认为三乙胺-HCl体系是比较理想的缓冲液。
       3.2 体系pH值的影响缓冲溶液的pH值是影响分离检测的一个重要因素，缓冲溶液的酸度直接影响毛细管表面的Zeta电势，从而影响电渗流(EOF)的方向和速率;同时溶液的酸度也决定样品中各组分分子的表观电荷数，继而影响组分的迁移时间和分离度。在比较不同pH值对分离效果的影响中发现，当pH值低于10.0时，峰形很差;在pH值于10.0～10.60之间，分离度逐渐加大;pH值为10.60时，OA和UA的峰形好，基线稳定，其原因可能是在此pH值条件下，OA和UA的羧基与三乙胺存在弱配合作用，形成的复合阴离子在电渗流作用下向负极移动，在流经检测器时电导值发生变化而被检测。
       3.3 缓冲液浓度的选择三乙胺的浓度对分离产生很大的影响，在本实验中，保持pH=10.60及环糊精浓度为0.24 mmol·L-1不变的情况下，依次改变三乙胺的浓度(0～2 mmol·L-1)发现，随着浓度的增加，OA和UA的分离度及峰面积随之增加，但在浓度大于1.2 mmol·L-1时，分离度保持在1.5～2.0之间，并不会发生很大变化，而且此时电流增加，基线不平，迁移时间后移。因此在保证分离度的情况下，选择三乙胺的浓度为1.2 mmol·L-1，见图2。图2 三乙胺浓度对迁移时间的影响
       3.4 添加剂的选择由于OA和UA属于构造异构体，空间结构中只有一个甲基的位置不同，在未加任何添加剂的情况下，检测时只有一个峰而无法实现分离。在保持体系不变，实验对SDS(十二烷基硫酸钠)、熊去氧胆酸、β-环糊精、HP-β-环糊精分别进行考察，发现SDS、熊去氧胆酸无法分离OA和UA，HP-β-环糊精分离效果不佳，β-环糊精能够对OA和UA产生较好的分离效果。
       随后对β-环糊精浓度进行了实验考察，在0.02 ～0.6 mmol·L-1范围内，进样OA和UA混合对照品。当浓度低于0.24 mmol·L-1，标准品分离度达不到1.5;浓度在0.24～0.4 mmol·L-1，分离度又逐渐下降，且迁移时间延长;浓度大于0.6 mmol·L-1时，对照品无法分离，见图3。这是由于随着环糊精浓度的增加，相应增加了包结物的浓度，体系粘度增大，延长出峰时间;且浓度增加影响缓冲液的电渗流，溶液中各组分的电泳浓度也发生变化，从而影响分离度。经过对供试品和对照品的多次实验，选择β-环糊精浓度为0.24 mmol·L-1。图3 β-环糊精浓度对分离度的影响
       3.5 电压、温度及湿度的影响随着电泳电压的增加(7～20kV)，样品出峰时间缩短，分离度变小，且电流显著增加，从焦耳热的影响和毛细管散热来考虑，选择12.5kV为最佳分离电压。见图4。实验中还发现，随着温度的改变及室内相对湿度的变化，对实验重现性有很大的影响，因此选择实验环境为25℃，相对湿度<45%为宜。图4 电压对迁移时间的影响
       3.6 供试品提取方法的选择实验比较了甲醇、95%乙醇、乙醚、三氯甲烷4种提取溶剂，乙醚、三氯甲烷提取液的杂质较少，但提取率不高，甲醇与95%乙醇提取率相当，而甲醇提取液色谱图杂质峰少，对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰,基线较平稳。选择甲醇作溶剂后，对比超声、索氏、加热回流3种提取方法，结果发现超声2 h和索氏提取的提取率均不如加热回流2 h的提取率，用加热回流的样品基线稳定，提取完全，OA和UA的检测状况良好。
       4 结论
       在优化的实验条件下，这几种药材中的OA和UA可以在6min之内得到很好的分离，并且进行含量测定，该高频电导检测器使用方便，灵敏度较高，实验重现性和精密度都比较理想。由于其自身的特点和优势，随着研究的深入，其应用潜力在毛细管电泳分离中草药成分中会得到更大的发挥。
       【参考文献】
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