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       【摘要】 
       目的建立毛冬青药材的含量测定方法。方法采用Lichrospher-C18色谱柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液(37∶63)，流速1 ml/min，蒸发光散射检测器：漂移管温度107℃，气体流速2.6 L/min。结果毛冬青皂苷甲在5.19～64.88 μg浓度范围内线性关系良好，r=0.999 8(n=6)，平均回收率为100.26 %，RSD= 1.09 % (n= 6);毛冬青皂苷B2在0.9～11.25 μg浓度范围内线性关系良好，r=0.999 7(n=6)，平均回收率为101.39 %，RSD=1.46 % (n=6)。结论该法操作快速、准确，可作为毛冬青药材的质量控制方法。
       【关键词】  毛冬青药材; 毛冬青皂苷甲; 毛冬青皂苷B2; 高效液相-蒸发光散射
       Determination of Ilexsaponin A1and IlexsaponinB2 Contents in Ilex pubescens by HPLC-ELSD
       CHENG Xinju，
       LI Jiaping，
       YUAN Haiming，
       LI Yan,
       ZENG Xianyi
       (Jiangxi Medicinal Research Institute, Nanchang,330029,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC-ELSD method for the determination of Ilexsaponin A1 and Ilexsaponin B2 contents in Ilex Pubescens.
       MethodsLichroshper-C18 (4.0 mm×250 mm，5 μm) column was used in HPLC with An evaporative light-scattering detector.Mobile phase was Acetonitrite-0.1%Acetic acid (37∶63), the flow rate was 1 ml/min: drift tube temperature was 107℃,and gas flow rate was 2.6 L/min.
       ResultsThe linear range of ilexsaponin A1 was within 5.19 ～ 64.88 μg, r=0.999 8(n=6).The average recovery was 100.26%，RSD=1.09% (n=6). The linear range of ilexsaponin B2 was within 0. 9 ～ 11.25 μg,r=0.999 7(n=6). The average recovery was 101.39%，RSD=1.46% (n=6).
       ConclusionThis method is rapid and accurate. It can be used for quality control of Ilex Pubescens.
       Key words： Llex pubescens; Llexsaponin A1; Ilexsaponin B2; HPLC-ELSD
       毛冬青药材为冬青科冬青属植物毛冬青Ilex pubescens Hook et Arm 的干燥根，生长在我国南方地区，具有清热解毒，活血通脉，消肿止痛的功效。近年来对毛冬青的许多研究证明毛冬青药材中含有大量的皂苷类活性物质[1～4]。为了很好的利用这一资源，我们对毛冬青药材进行了质量控制技术的研究，建立高效准确的分析测定方法，本文首次采用高效液相-蒸发光散射(HPLC-ELSD)的测定方法，同时对毛冬青药材中的毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2两种成分进行了含量测定的方法学研究[5]，取得了满意的结果。
       1 仪器和试药
       岛津LC-10AD泵，Alltech 500 ELSD检测器，Sepu3000色谱工作站。毛冬青皂苷甲对照品(批号：081211，含量100%)自制;毛冬青皂苷B2对照品(批号：080709，含量100%)自制。毛冬青药材：各地采挖。乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为重蒸水。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Lichrospher 100 RP-18 (4.0 mm×250 mm，5μm);流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液(37∶63);流速1ml/min;蒸发光散射检测器(飘移管温度为107℃，气体流速为2.6 L/min)。
       2.2 测定方法
       2.2.1 对照品溶液的制备 取毛冬青皂苷甲对照品和毛冬青皂苷B2对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含毛冬青皂苷甲为4 mg;毛冬青皂苷B2为0.9 mg的混合溶液，即得。
       2.2.2 供试品溶液的制备取毛冬青药材粉末(过4号筛)，约1.5 g，精密称定，置250 ml回流瓶中，加100 ml的乙醇，回流2 h，取下，滤过，然后用乙醇洗涤数次，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解到10 ml量瓶中，摇匀，即得。
       2.2.3 测定法分别精密吸取对照品溶液5 μl和10 μl;供试品溶液5～10 μl注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
       2.3 专属性实验取对照品和供试品溶液按上述方法进行测定，结果在毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2对照品相应的保留时间处有相同的峰，周边无其它杂质峰干扰。毛冬青皂苷B2的保留时间在9 min左右，毛冬青皂苷甲的保留时间在11 min左右，理论板数以毛冬青皂苷甲的峰计大于8 000。结果见图1。
       2.4 蒸发光散射检测器的条件考察
       2.4.1 漂移管温度的选择在上述色谱条件下，先固定漂移管的气流量为2.5 L/min，改变漂移管温度，用毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲混合对照品溶液进样，记录色谱图，测定两个对照品的峰面积及信噪比(S/N)，选择峰面积和信噪比两者均为最大值时的温度，从实验结果中得到最优化的漂移管温度为107℃。
       2.4.2 漂移管中气流量的选择在上述色谱条件下，固定漂移管的温度为107℃，改变漂移管的气流量，用毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲混合对照品溶液进样，测定两个对照品的峰面积及信噪比(S/N)，选择峰面积和信噪比两者均为最大值时的气流量，从实验结果中得到最优化的漂移管气流量为2.6 L/min。因此，蒸发光散射检测器的条件选择：飘移管温度为107℃，气体流速为2.6 L/min。
       2.5 标准曲线的制备分别取毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲对照品各约9 mg和52 mg，同置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，从中吸取1，2，5，7.5，10和12.5 μl注入色谱仪中进行测定，结果毛冬青皂苷甲在5.19 ～64.88 μg的范围内，浓度与峰面积的对数值呈一直线，回归方程为logA=1.329 7 logC + 4.6775, 相关系数 r=0.999 8( n=6 );毛冬青皂苷B2在0.9 ～11.25 μg的范围内，浓度与峰面积的对数值呈一直线，回归方程为logA = 1.551 8 logC + 4.512 6 , 相关系数r=0.999 7( n=6 )。1. 毛冬青皂苷B2 2. 毛冬青皂苷甲图1 混合对照品(A)和样品(B)色谱图
       2.6 溶液的稳定性实验取供试品溶液1份，在不同的时间点测定，结果在24 h内稳定性很好。
       2.7 重复性实验取同一批毛冬青药材，分别制配6份相同浓度的供试品溶液进行测定，计算得毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的平均含量分别为2.09%和0.44%，RSD分别为0.85%和1.33%。
       2.8 回收率实验取同一批毛冬青药材适量，加入一定量的毛冬青皂苷B2和毛冬青皂苷甲对照品，共6份，制成供试品溶液，进行测定，计算毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2平均回收率分别为100.26%和101.39%，RSD分别为1.09%和1.46%。结果见表1～2。表1 毛冬青皂苷甲的回收率实验结果
       2.9 药材的测定对从不同产地、不同时间采集的毛冬青药材，经干燥粉碎，过4号筛，分别取1.5 g，精密称定，按上述方法操作，测定。结果见表3。表2 毛冬青皂苷B2的回收率实验结果　表3 毛冬青药材含量测定结果
       3 讨论
       毛冬青药材中的大部分皂苷类物质没有紫外吸收，我们采用蒸发光散射检测器对其中的皂苷类物质进行检测，可得到满意的结果。
       本药材试用过不同浓度的乙醇和甲醇，超声和回流提取不同的时间，实验结果表明，毛冬青药材采用95%乙醇100 ml，回流2 h，提取比较完全，毛冬青皂苷甲和毛冬青皂苷B2的含量均最高。
       本法中浓度和峰面积的对数值曲线为一良好的直线，此直线未过原点，因此在本方法中应采用外标两点对数方程来进行计算。测定时分别精密吸取混合对照品溶液5 μl和10 μl;及供试品溶液5～10 μl注入液相色谱仪。
       本方法经实验证明，准确性高，重复性好，简便快速，适合作为毛冬青药材的质量控制方法。
       【参考文献】
         　[1] 宋立人，洪 恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典，上册[M].北京：人民卫生出版社，2001：419.
       
       [2] 王本祥.现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1999：919.
       
       [3] Kazuyuki Hidaka, Miyoko Ito, Yoko Matsuda，et al. New Triterpene Saponins from Ilex Pubescens[J]. Cham.Pharm.Bull，1987,35(2)：524.
       
       [4] 冯 锋，朱明晓，谢 宁.毛冬青化学成分研究[J]. 中国药学杂志，2008，43(10)：732.
       
       [5] 陈新菊，利家平，袁海铭，等.HPLC-ELSD法测定毛冬青药材中Ilexgenin A的含量[J].时珍国医国药，2009，20(6)：1337.