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       【摘要】 
       目的为野菊花中主要黄酮成分蒙花苷提取工艺的确定提供实验依据。方法采用正交设计的方法优化提取方案，RP-HPLC法测定蒙花苷的质量分数。结果最终确定优化提取方案为80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，每次2 h。结论提取溶剂量和提取时间对提取效率具有显著影响，应加以控制。优化方案提取效率明显高于正交设计中所有9个实验的提取效率。
       【关键词】  正交设计; 野菊花; 蒙花苷; RP-HPLC; 提取工艺
       Optimization of Extraction Technology of Linarin from Chrysanthemum indicum L. with Orthogonal Design
       ZHANG Ming，
       CHENG Wenming*，
       LI Jun，
       LU Weili，
       ZHANG Yunjing，
       ZHANG Qunlin
       (School of Pharmacology, Anhui Medical University·Key Laborotary of Natural Product Bioactivity of Anhui Province, Heifei 230032,China)
       Abstract：ObjectiveTo provide a basis for the optimum extraction technology of Linarin from Chrysanthemum indicum L..
       MethodsThe orthogonal design and RP-HPLC method were used.
       ResultsThe optimum extraction condition was selected as eight times amount of 80% alcohol and refluxing 2 h repeatedly for 3 times.
       ConclusionThe volume of solvent and extracting time had obvious effect on the extracting efficiency of the three flavonoids in Chrysanthemum indicum L. The optimal method is superior to the nine experiments in orthogonal design.
       Key words： Orthogonal design; Chrysanthemum indicum; Linarin; RP-HPLC; Extraction technology
       野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的头状花序，别名为野黄菊花、苦薏、山菊花、甘菊花，作为常用药材收录于2005版《中国药典》(Ⅰ部)中。其性凉，味苦、辛，归肺、肝经，具有清热解毒、消散痈肿、疏风平肝之功效，在我国的药用历史悠久。现代药理证明：野菊花具有广谱抗菌、抗病毒、降压、增加冠脉血流量、清除活性氧自由基等作用。现今临床上已将野菊花应用于风热感冒、高血压病、肺炎、口疮、痈疖等疾病的治疗[1]。蒙花苷为野菊花中黄酮化合物的代表成分，在野菊花中有较高的含量。本实验以其质量分数为指标，采用正交设计法，从提取溶剂、提取时间、溶剂量以及提取次数入手，对蒙花苷的提取工艺进行优化。
       1 试剂与仪器
       无水乙醇(上海振兴化工厂，批号：200905317)、甲醇(购自江苏科瑞思特工贸有限公司，批号：200705288)、双蒸水(自制)、冰醋酸(国药集团化学试剂公司，批号：T20081010)。除甲醇为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。蒙花苷(批号：111528-200303)对照品均购自中国药品生物制品检定所。
       蒸发回流装置、水浴锅、岛津LC-20A高效液相色谱仪、岛津SIL-20A自动进样器、岛津CTO-10As VP柱温箱、岛津SPD-20AU紫外检测器、十万分之一分析天平。超声提取器(昆山市超声仪器有限公司)。
       2 方法与结果[2]
       2.1 提取工艺的筛选提取工艺设计：取野菊花药材3 g各9份，根据有关资料和预实验，以提取溶剂(A)、溶剂量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，每个因素选择3个水平，选用L9(34)正交表进行实验，以蒙花苷百分含量为考察指标，按照L9(34)正交设计实验表进行实验，提取液置于容量瓶中，用提取溶剂定容至刻度。因素水平表见表1。表1 因素水平表
       2.2 色谱条件色谱柱：大连依利特ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱; 流动相：A相为甲醇，B相为2.5%冰醋酸水溶液，进行梯度洗脱，0～12 min，由85%～80%，12～15 min，由80%～72%，15～25 min，由72%～60%，25～40 min，由60%～45%，40～50min，由45%～5%，50～60 min为5%;流速：1 ml/min;柱温：35 ℃;进样量：20 μl;检测波长：326 nm。图1 蒙花苷标准品HPLC色谱图
       2.3 标准品的制备精密称取蒙花苷标准品1.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得标准品原溶液，备用。蒙花苷标准品色谱图见图1。
       2.4 线性关系的考察精密吸取蒙花苷标准原液0.5 ml，置于5 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。以此方法等比稀释3次。再吸取标准原液1 ml，置于5 ml容量瓶中，稀释至刻度，以此方法等比稀释2次。分别吸取上述溶液20 μl进样，在上述色谱条件下进行分析，以标准品质量浓度的对数为横坐标，峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得蒙花苷回归方程为 Y=0.981 8X+10.522，R2=0.999 8，n=7。表明蒙花苷浓度范围在0.1 ～100 mg/L内，线性关系良好。
       2.5 样品溶液的制备与含量测定 精密吸取提取液适量置于5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过滤。置于1 ml进样瓶中，每次进样20 μl，测定蒙花苷峰面积，代入回归方程，计算百分含量。样品色谱图见图2。图2 样品HPLC色谱图
       2.6 结果根据以上实验方法测得蒙花苷质量分数，实验结果见表2，方差分析见表3。表2 正交实验L9(34)及结果表3 方差分析表以蒙花苷的提取质量分数之和为指标，由表1中我们可以发现，提取溶剂的优水平为A3，溶剂量的优水平为B2，提取时间的优水平为C3，提取次数的优水平为D3。因此，蒙花苷提取工艺的优组合为A3B2C3D3，即80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，每次3 h。各因素对提取效率的影响主次顺序为D>B>A>C。由于提取时间对提取效率影响不大，为减少多次实验对工作量的增加和试剂的损耗，故选取提取时间作为方差分析中的误差列。根据方差分析可以看出，在P<0.05的条件下，溶剂量和提取次数具有显著性意义，而提取溶剂对提取效率影响不显著。同时，发现提取时间3 h比2 h的提取效率提高的并不明显。为节约时间，最终确定优化方案为80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，2 h/次。
       2.7 验证性实验为了检验实验结果的可靠性，选取优化方案进行重复实验。结果见表4。实验结果为蒙花苷的平均质量分数为2.87%。结果高于全部9个正交实验。由此我们可以得出，此优化方案具有较高的可靠性及合理性。表4 验证实验结果
       3 讨论
       已有文献报道采用比色法作为检测手段对野菊花总黄酮提取工艺的比较[3]，但总黄酮成分复杂，因此，比色法测定时干扰较多，并且无法确切了解野菊花中主要成分如蒙花苷的提取效率。由于HPLC法对中药成分能进行较好的分离，结果较可靠，故选取RP-HPLC法对野菊花中蒙花苷的提取工艺进行优化，提高其提取效率。本方法所用检测波长为蒙花苷的最大吸收波长，即326 nm;以甲醇与2.5%冰醋酸水溶液为两相溶剂进行梯度洗脱;结果表明，此方法对样品中蒙花苷的分离及含量测定具有满意的效果。
       目前应用较为广泛的野菊花提取方法为回流提取法以及超声提取法[4]，本实验在应用单因素分析法考察了30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇以及超声提取法对提取效率的影响后，发现在70%乙醇的条件下，野菊花的提取效率较高;同时与超声提取相比，回流提取所需设备简单，价格便宜，有利于工业上推广。故选取回流提取法作为提取方法。正交实验结果表明，优化提取方案为80%乙醇，按8倍药材质量的溶剂量，提取3次，每次2 h。
       【参考文献】
         　[1] 王 丹.药用植物野菊花的研究现状及发展前景[J].现代中药研究与实践，2007, 21(4): 59.
       
       [2] 巴根那，吉林百乙，白玉霞，等.正交设计研究广枣总黄酮提取工艺[J].中成药，2000, 22(4): 253.
       
       [3] 罗显华，郁建生.野菊花总黄酮的提取与纯化[J].食品科技，2008， 7: 179.
       
       [4] 朱庆书，赵文英.超声提取野菊花中黄酮及其抑菌活性的研究[J].化学与生物工程，2008， 25(12): 72.