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       【摘要】 
       目的研究松花粉总黄酮对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用，探讨其疗效机制。方法松花粉总黄酮予小鼠连续灌胃给药10 d，用CCl4造成小鼠急性肝损伤，测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量，以及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平，观察光镜下小鼠肝组织的病理变化。结果松花粉总黄酮高、中、低各剂量组均能抑制小鼠腹腔注射CCl4引起的急性肝损伤所致的ALT和AST的升高，同时能升高肝组织中SOD的活性，并能降低MDA的含量;减轻肝组织坏死程度。结论松花粉总黄酮对四氯化碳所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其保护机制可能与其抗脂质过氧化有关。
       【关键词】  松花粉总黄酮; 急性肝损伤; 四氯化碳
       松花粉药名松黄，是松科植物马尾松Pinus massoniana，油松P. tabulaeformi或同属数种植物于春季花刚开时，采摘花穗晒干收集，除去杂质所得的淡黄色细花粉，其成分稳定、不含激素，是花粉产品中的佼佼者。松花粉是我国传统食药兼用的花粉品种，神农本草、本草纲目等多种医籍中均有记载，有润心肺、益气、祛风止血、养颜益志、强身健体的功能[1]。作为古老的药源和营养源，国家卫生部近年已确认松花粉为新资源食品，并将其列为普通食品管理[2]。松花粉中的多种酶、核酸、有机酸、黄酮等生物活性物质能调节人体机能，具有延缓衰老，促进新陈代谢的功能，对于保健及功能药物的开发具有重要意义[3]。
       本研究采用CCl4小鼠急性肝损伤模型，运用酶活力测定，抗脂质过氧化物测定以及形态学观察等方法，研究松花粉总黄酮(Flavone in Pinus Massoniana pollen，FPMP)对小鼠急性肝损伤的保护作用并探讨其保护机制。
       1 材料
       1.1 药物 马尾松花粉采自云南腾冲高黎贡山南麓。将松花粉晒干后冷冻超微粉碎，石油醚回流脱脂，95%乙醇回流浸提，提取后减压回收乙醇，浸膏加适量水溶解，取水层浓缩后加入已处理好的聚酰胺柱中洗脱，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干即得松花粉总黄酮，以芦丁为标准测定黄酮含量为67.80%。松花粉总黄酮用双蒸水配成所需浓度。
       1.2 试剂 联苯双酯滴丸(广州星群药业股份有限公司);四氯化碳(天津市四通化工厂);鲁花纯正花生油;ALT，AST，MDA，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
       1.3 仪器 高速冷冻离心机(BECKMAN仪器公司J2-HS722);生化分析仪(日本日立公司Hitachi 7600-020);分光光度计(南京第四分析仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海予华仪器有限公司);电热恒温水浴箱(杭州中拓仪器有限公司)。
       1.4 动物 60只雄性昆明种小鼠，体质量(20±2)g，南方医科大学医学动物实验中心提供。
       2 方法
       2.1 模型建立[4，5]取昆明种小鼠60只，随机分为6组，即空白对照组、联苯双酯组、CCl4模型组及松花粉总黄酮高、中、低剂量组。联苯双酯组灌胃给予联苯双酯混悬液150 mg·kg-1;松花粉总黄酮3个剂量组分别灌胃给予松花粉总黄酮15，30，60 mg·kg-1。空白对照组和CCl4模型组给予同等量的蒸馏水。连续10 d后除空白对照组外其余各组均腹腔注射0.5% CCl4油溶剂0.1 ml·10 g-1(此即CCl4的给药方式，为一次性给药造成急性肝损)。禁食24 h后摘眼球取血，静置30 min， 3 000 r·min-1离心10 min后分离血清，待测血清中AST及ALT含量。取肝组织，用生理盐水洗去残血并用滤纸滤干，剪成小块。称取100 mg，加预冷生理盐水0.9 ml制成10%匀浆，待测肝组织SOD活性和MDA的含量。取肝大叶相同部位的一小块肝组织固定于10%福尔马林，做病理切片检查。
       2. 2 生化检测 分离得到的各组小鼠血清，按照试剂盒说明测定ALT和AST的活力。10%肝组织匀浆4℃ 3 500 r·min-1离心10min后取上清液，按照试剂盒说明测定SOD活性和MDA的含量。
       2. 3 形态学观察 所取小鼠肝组织用10%福尔马林固定，制备肝组织切片，HE染色，普通光镜下观察肝组织病理结构改变。
       2. 4 统计方法 组间比较采用Cochran & Cox近似t检验，数据用±s表示，P<0. 05为差异显著，P<0. 01为差异极显著。
       3 结果
       3. 1 对血清中ALT和AST含量的影响 CCl4模型组与空白对照组比较，血清ALT及AST均明显增高(P<0. 01)。与CCl4模型组比较，松花粉总黄酮高、中、低剂量组均可明显降低肝损伤小鼠血清ALT及AST活力。表1 松花粉总黄酮对小鼠急性肝损伤血清中ALT，AST活力的影响
       3. 2 对肝组织中MDA和SOD含量的影响CCl4模型组与空白对照组比较，肝组织中MDA含量明显增高，SOD活性明显降低(P<0.01)。与CCl4模型组比较，松花粉总黄酮高、中剂量组均能明显降低肝损伤小鼠肝组织中MDA含量并能增高SOD的活性。表2 松花粉总黄酮对小鼠急性肝损伤肝组织中MDA含量、SOD活性的影响
       3. 3 对四氯化碳肝损伤小鼠肝脏病理组织的影响 肉眼观察，空白对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性;模型组小鼠肝脏外观体积肿大，质脆，边缘钝而厚，表面呈暗红色。镜下可见空白对照组小鼠肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，结构及形态正常，肝细胞索状结构清晰可辨，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦清晰;模型组小鼠肝小叶正常结构被破坏，肝细胞明显肿胀变性，细胞境界不清，细胞索解离，细胞肿胀、混浊，可见较多的点状、片状坏死灶，肝组织充血，伴有淋巴细胞、单核细胞广泛浸润。松花粉总黄酮高中剂量组及联苯双酯组小鼠较模型组肝损伤程度明显减轻，镜下可见松花粉总黄酮高、中剂量组及联苯双酯组的肝小叶结构基本完整，细胞排列较整齐，肝细胞肿胀、坏死、肝组织充血明显减轻，有少量的肝细胞脂肪变性和较少的炎症细胞浸润，而小剂量组大鼠的肝组织充血、肝细胞坏死及炎症细胞浸润较明显，亦可见点状或带状坏死。
       4 讨论
       肝病是一种发病率高、难以根治的疾病，对人类健康危害极大。各种病因引起的急性肝病及有毒物质所致的肝脏损伤均可引起肝细胞炎症或坏死，并继发纤维化的病理过程。大量研究表明，在肝细胞病变过程中，自由基、酶以及脂质过氧化等均发挥重要作用。保护肝细胞，减少各种损伤因素，可以防止或延缓肝纤维化的形成。
       CCl4为重要的化工原料和有机溶剂，是实验性肝损伤动物模型所用的外源性化合物，主要经呼吸道和消化道进入体内， 四氯化碳(CCl4)肝损伤为目前国际常用的肝炎模型之一[6]， 也是经典的筛选和研究治疗肝炎类药物的病理模型。在形态学、病理生理学的某些方面与人慢性肝病较为相似[7,8]。
       CCl4进入体内后，在肝微粒体细胞色素P450作用下激活后形成三氯甲基自由基(·CCl3)、二氯甲基自由基(·CCl2)及过氧化甲基自由基(·OOCCl3)等[9]，这些自由基可攻击脂质细胞膜下的不饱和脂质，引起肝细胞脂质过氧化性损伤[10]，脂质过氧化产物对细胞膜的结构和功能造成不可逆转的改变[11]。AST和ALT是肝损伤的标志酶，在正常条件下，这些酶主要存在于细胞核和线粒体内，当细胞膜受到损伤时就会释放，在体液中流通，故血清中AST和ALT酶活性的升高为反映肝功能受损的特异性指标[12,13]。在引起脂质过氧化同时，CCl4还能减弱体内内源性抗氧化酶(如SOD)活性，致使大量自由基无法清除，MDA是脂质过氧化的主要降解产物，可进一步损伤肝细胞的结构，导致肝细胞坏死。
       因此，增强机体抗氧化能力，可能成为预防CCl4肝损伤的重要途径[14,15]。本研究结果表明，对小鼠预先使用松花粉总黄酮，能显著降低CCl4引起的急性肝损伤后血清中ALT和AST的水平，明显减轻肝细胞的变性坏死和炎性浸润等病理改变，同时还明显降低肝组织MDA的含量，并且有效提高了SOD的活力。这些结果提示，松花粉总黄酮对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用，可能与其通过提高机体抗氧化酶的生物合成而增加酶活力，清除自由基抑制脂质过氧反应，降低脂质过氧化主要产物MDA的产生，提高肝细胞抗氧化能力，从而拮抗CCl4引起的膜脂质过氧化，促进肝细胞的再生和修复有关。肝组织的病理检验结果也证实了这一点。更深入的作用机制有待进一步研究。
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