文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的建立利用HPLC法测定长萼小连翘Hypericum erectum ssp. longisepalum中金丝桃素含量的方法。方法Supelcosil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶水∶0.3%磷酸 = 45 ∶50∶4.5∶0.5 (三乙胺调pH值至6.0)，检测波长590 nm，流速1 ml/min，线性范围4.38～44.7 μg/ml。结果相同生境下的长萼小连翘中金丝桃素含量约为贯叶连翘中的3.6倍;长萼小连翘中金丝桃素的含量随着海拔高度的升高呈逐渐下降趋势;金丝桃素在长萼小连翘各部位中以花和幼果中含量最高，可高达0.774%～1.136%，在叶中的含量也可高达0.4%左右，但在根和茎中含量极低。结论长萼小连翘中金丝桃素含量明显高于贯叶连翘，其可能成为一种金丝桃素新优植物资源。
       【关键词】  长萼小连翘; 金丝桃素; 高效液相色谱法
       长萼小连翘Hypericum erectum ssp. longisepalum系藤黄科金丝桃属植物[1]。金丝桃素(hypericin)是金丝桃属植物中具有抗艾滋病病毒等多种逆转录病毒、抗抑郁和抗肿瘤等生理活性的成分[2]，也是该属植物的特征成分之一。其不同纯度产品广泛应用于抗抑郁食品补充剂、神经保健剂、动物抗病毒饲料添加剂等，同时又是抗艾滋病病毒(HIV病毒)新药的热点化合物[3～5]。过去对金丝桃素的源植物及应用开发研究主要集中在贯叶连翘H. perforatum L. 。关于长萼小连翘的相关研究报道是在近期才见，如白洁等[6]利用HPLC /DAD /ESI2MS分析鉴定了湖北巴东产长萼小连翘的化学成分，明确该植物中含有金丝桃素和伪金丝桃素等成分。而我们在进一步对该植物金丝桃素的含量测定中发现，其全株中金丝桃素的含量显著高于贯叶连翘这一传统金丝桃素植物资源。因此，我们对该植物资源进行了深入的金丝桃素含量分析，为长萼小连翘这一新的含量更高的金丝桃素植物资源的开发利用奠定基础。
       1 仪器与材料
       1.1 HPLC检测仪器DIONEX P680 HPLC PUMP泵;DIONEX UVD170U紫外检测仪。
       1.2 药品金丝桃素对照品(HPLC法自制，纯度96.34%)。
       1.3 材料花果期(8～10月)野生长萼小连翘全株实验材料采自湖北巴东大支坪至耀英坪一带，海拔900～1 450 m，按不同海拔和部位对实验材料分类后阴干。花期(8月)野生贯叶连翘材料采自湖北巴东大支坪，海拔980 m，生境与同海拔下的长萼小连翘相同，采集部位为花枝20～40 cm部分，阴干。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件Supelcosil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相：等度洗脱，甲醇∶乙腈∶水∶0.3%磷酸 = 45 ∶50∶4.5∶0.5 (三乙胺调pH值至6.0);检测波长：590 nm;流速：1 ml/min。
       2.2 对照品与供试品溶液制备
       2.2.1 样品溶液的制备样品粉碎，过40 目筛，分别称取5.00 g于三角烧瓶中加入50毫升95%的乙醇避光超声提取3次，每次20 min，过滤，合并滤液，45℃以下减压浓缩除去部分溶剂，定容为250 ml。0.45 μm微孔滤膜过滤后，进样分析。
       2.2.2 金丝桃素标准曲线的测定精密取金丝桃素对照品溶液(40 μg/ml)1.0，2.0，4.0，5.0，10.0 ml于10 ml容量瓶，甲醇定容至刻度，为1，2，3，4，5号对照品溶液，混均，0.45 μm滤膜过滤。各浓度对照品溶液分别以20 μl进样3次，以平均峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程：A=439 763 C +305 002，相关系数r=0.999 1，线性范围4.38～44.7 μg/ml。
       2.3 方法学考察
       2.3.1 精密度取金丝桃素对照品溶液重复进样5次，计算峰面积RSD。RSD=3.11%。
       2.3.2 稳定性取金丝桃素对照品溶液，于0，4，8，12，24 h分别进样分析，计算峰面积的RSD。RSD=4.18%。
       2.3.3 重复性取同一批样品5份，每份约5 mg，按上述操作平行测定5次，计算金丝桃素含量的RSD。RSD=1.29%。
       2.3.4 加样回收率取已知金丝桃素含量的样品5份，每份约5 mg，精密加入金丝桃素对照品溶液(40 μg/ml)1 ml，按上述操作测定峰面积，计算加样回收率。平均加样回收率为100.7%，RSD=3.46%。以上结果表明该方法符合含量测定的要求。
       2.4 含量测定按“2.2”项下制备每种待测样品的溶液，进样量10 μl。测定结果见表1～2。
       3 讨论
       从测定结果可以看出，长萼小连翘全株中的金丝桃素含量与产地的海拔有关，随着海拔高度的升高金丝桃素的含量呈逐渐下降趋势。根据我们对模式标本产地附近的湖北恩施、建始、宣恩、利川等海拔250 m至1 450 m的山地资源采集与调查，在海拔980 m以下和1 500 m以上的山地未见有长萼小连翘分布。但相同产地(海拔980 m)的长萼小连翘中的金丝桃素含量约为贯叶连翘中的3.6倍。由于长萼小连翘金丝桃素的含量显著高于贯叶连翘这一传统金丝桃素植物资源，提示长萼小连翘可能成为一种金丝桃素新优植物资源。表1 贯叶连翘和不同海拔长萼小连翘中金丝桃素的含量表2 海拔1 240 m野生长萼小连翘不同部位金丝桃素的含量金丝桃素在长萼小连翘各部位中以花和幼果中含量最高，可高达0.774%～1.136%，在叶中的含量也可高达0.4%左右，但在根和茎中含量极低。
       通过对长萼小连翘不同海拔(980～1 680 m)所产和不同部位的含量测定，可以为长萼小连翘这一可能的金丝桃素新优植物资源在进一步的人工种植和科学采收研究中给予提示和指导。就以上测定结果可以初步设定其第1阶段的人工栽培实验适宜地为鄂西山区海拔1 000 m左右，以尚带少量花的幼果期为最佳采集期，以带叶、花和果的枝条为最佳采集部位，并可留根翌年发芽而可持续采收。
       另一方面，进一步开展对长萼小连翘这一高含量的金丝桃素新植物资源在化学、药理和资源保护方面的研究工作，可为其应用开发奠定基础。
       【参考文献】
         　[1] 吴立宏，杨得坡，王发松，等. 国产金丝桃属(藤黄科)新植物[J]. 植物分类学报, 2004, 42(1):73.
       
       [2] 祝艳华，张 忠，毛景东.金丝桃素抗病毒作用的研究进展[J].内蒙古民族大学学报，2008，14(4)：100.
       
       [3] Yves P, Allison A J, Christophe M. Integrase Inhibitors to Treat HIV/AIDS[J]. Nature Reviews (Drug Discovery), 2005, 3 (4): 236.
       
       [4] 许以明，陆传宗.人类免疫缺损病毒(HIV)的空间结构及金丝桃蒽酮素诱导的HIV光敏损伤的Raman光谱研究[J].中国科学C辑，2004，34(5)：444.
       
       [5] 胡冬华，高 颖，邵 琛，等.贯叶连翘有效成分金丝桃素与 HIV逆转录酶相互作用的研究[J].分子科学学报，2008，24(4)：280.
       
       [6] 白 洁, 王冬梅, 杨得坡. 长萼小连翘醇提物中黄酮类与金丝桃素类成分的 HPLC /DAD - MS联用分析[J]. 分析测试学报，2008，27 (2): 185.