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       【摘要】 
       目的研究枸杞多糖诱导人肝癌细胞Bel-7402的凋亡作用及其作用机制。方法体外培养的人肝癌细胞Bel-7402，细胞经不同剂量枸杞多糖(LBP)处理后,采用MTT法测定细胞的增殖情况,流式细胞仪分析LBP对Bel-7402细胞周期和凋亡的影响,用RT-PCR技术检测Bel-7402细胞SurvivinmRNA的表达。结果LBP可明显抑制人肝癌细胞Bel-7402的生长,并能诱导Bel-7402细胞凋亡,凋亡率(%)分别为(6.20±0.62)，(12.80±0.47)和(18.10±0.70),与对照组比较,差异有非常显著性(P<0.01);各剂量药物处理组的肿瘤细胞Survivin mRNA表达水平均明显降低(P<0.01)。结论枸杞多糖可抑制Bel-7402细胞增殖,诱导细胞凋亡,该作用可能与下调细胞Survivin 表达有关。
       【关键词】  肝癌; 枸杞多糖; 细胞凋亡; 基因表达
       枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharides ,LBP) 是枸杞子的提取物,具有多种生物活性作用[1]及抗肿瘤功能[2],并能诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制其增殖[3]。然而其诱导人肝癌细胞Bel-7402的凋亡及其机制尚未见报道。本文旨在探讨(LBP) 对人肝癌细胞Bel-7402凋亡的影响及其可能机制。
       1 材料
       1.1 药物与试剂人肝癌细胞株Bel-7402 ,由北京医科大学科研中心引入, 后经我校中心实验室传代。枸杞多糖由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取，纯度超过99%.RPMI1640、Trizol 及RT-PCR 酶混合物为美国GIBCO公司产品。四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)、二甲基亚砜(DMSO)及兔抗人Survivin单克隆抗体为美国Sigma公司产品,Survivin及β-actin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
       1.2 细胞株及其培养人肝癌细胞株Bel-7402置于RPMI1640 培养液中( 含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml) , 在37℃, 饱和湿度, 5%CO2 培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后, 经0.25%胰蛋白酶消化, 收集, 调配成相应的细胞浓度。
       2 方法
       2.1 分组及处理实验设空白对照组、溶剂对照组和5个不同质量浓度实验组,分别为LBP200，400和800 μg/ml。取对数生长期的Bel-7402细胞1×104 个/ml 接种于25 ml的培养瓶中培养,24 h后加入前述不同质量浓度的LBP ,作用48 h 后,胰酶消化离心,将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中,调质量浓度为1×106个/ml细胞悬液,备用。
       2.2 LBP对人肝癌细胞株Bel-7402周期和凋亡的影响取实验组和对照组细胞样品,1000r/min 离心10min,收集细胞,PBS洗涤2 次,配成1×106/ml细胞悬液,75%冷乙醇(- 20℃)固定24 h,上机测定前,离心去乙醇,用PBS 洗涤2次,加入不含Dnase 的RNA酶及EB染液,室温反应30min,上流式细胞仪测定细胞凋亡。
       2.3 原位末端标记法( TUNEL)由武汉博士德公司提供TUNEL检测试剂盒。光学显微镜下,胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。随机计数200个细胞,算出阳性细胞率。
       2.4 RT-PCR检测Survivin mRNA表达 细胞分组及处理同方法“2.1” ,按Trizol 试剂说明提取细胞总RNA ,进行RT-PCR 扩增,扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳,应用gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行分析。引物序列及扩增条件见表1。表1 Survivin及β-actin PCR引物序列及扩增条件
       2.5 统计学方法所有的数据均用±s表示,采用SPSS 软件包分析数据,各组间指数的比较采用单因素方差分析。
       3 结果
       3.1 LBP 对人肝癌细胞Bel-7402生长的影响3组不同质量浓度的LBP对体外培养的Bel-7402细胞均有抑制作用,且呈明显的剂量-效应关系,最大抑制率达65.49%。200 μg/ml组与溶剂对照组比较,差异具有显著性(P<0.05);400及800 μg/ml组与溶剂对照组比较,差异有显著性(P<0.01,表2) 。表2 LBP对人肝癌细胞Bel-7402生长抑制的影响
       3.2 流式细胞仪检测枸杞多糖对Bel-7402细胞凋亡的影响不同剂量的枸杞多糖对Bel-7402癌细胞有显著的促进细胞凋亡作用,呈剂量依赖关系。在DNA直方图的G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。枸杞多糖对Bel-7402细胞周期产生明显影响,G2/M期细胞明显增多,G0/G1期细胞比率明显减少,多数细胞阻滞在G2/M期。见表3。
       3.3 LBP对Bel-7402细胞Survivin mRNA表达的影响结果见图1。经不同浓度(200，400，800μg/ml)枸杞多糖处理48 h后, Bel-7402细胞Survivin mRNA 表达水平的校正值( survivin/β-actin) 分别为(0.725±0.11)、(0.317±0.04)和(0.204±0.04), 随枸杞多糖浓度增加Survivin mRNA 表达水平逐渐降低。400和800μg/ml 处理组显著低于对照组(0.873±0.04) (P<0.01)。见图1。表3 LBP对人肝癌细胞Bel-7402生长抑制的影响图1 图1 枸杞多糖对Eca-109 细胞Survivin mRNA表达的RT-PCR检测结果
       4 讨论
       细胞凋亡又称为细胞程序性死亡。通过细胞凋亡可保持机体组织的动态平衡， 是机体自我调控的重要机理。目前认为，许多肿瘤的发生就是由于该肿瘤细胞凋亡通道受阻而引起的。因此诱导肿瘤细胞凋亡成为抗肿瘤药共同的新靶点。甚至有学者认为细胞凋亡是不同作用机理抗癌药物殊途同归的结果[4，5]。
       枸杞多糖可显著抑制肿瘤细胞Bel-7402的生长,其抑制率可达65.49%,有明显的剂量依赖关系。流式细胞仪检测结果显示,枸杞多糖处理的细胞,其DNA 直方图上可见G1期峰前出现明显的细胞凋亡峰。最大剂量组的凋亡率可达18.1%。肿瘤细胞都有其自身的生长周期规律,一般G0/G1 期时间最长,故G0/G1 期细胞比率最高,而G2/M期时间较短,处于G2/M期细胞比率最低.不同的抗肿瘤药可能对不同增殖周期具有选择性。流式细胞仪检测结果显示,枸杞多糖对人肝癌Bel-7402细胞增殖周期有明显影响,药物使G2/M期细胞比率明显增加。这表明肿瘤细胞被阻止于G2/M期,更多的细胞损伤过重, 超过了自身修复能力,难以通过G2 期限制点而发生凋亡[6]。
       为了探讨枸杞多糖诱导Bel-7402细胞凋亡机制,本实验研究了不同浓度枸杞多糖(200、400和800 μg/ml)作用后Bel-7402细胞Survivin 基因的表达变化。Survivin 是细胞凋亡抑制基因,编码的蛋白属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisp rotein ,IAP) 家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin 主要表达于胚胎及分化未成熟的组织中,在成人体内除胸腺、生殖腺中有微量表达外,所有分化成熟的组织,均无表达,但在许多人类肿瘤组织中表达水平升高[7]Survivin通过直接抑制caspase-3和caspase-7,使二者分离,从而抑制caspase蛋白酶活性[8]。本实验结果显示,枸杞多糖作用后,Bel-7402细胞的SurvivinmRNA 表达减少,同样,Survivin蛋白表达也明显减少。
       【参考文献】
         　　[1] 薛立文,李以暖.枸杞子的营养和保健功能[J]. 广东微量元素科学,2000 ,12(7) :124.
       
       [2] 甘 璐,张声华.枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响[J].营养学报,2003,33(6):200.
       
       [3] 李卓能,罗 琼,杨明亮,等.枸杞多糖对人前列腺癌细胞生长的抑制作用[J].中华中西医杂志,2005,11(7):526.
       
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