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       【摘要】 
       目的探讨道地药材浙玄参与非道地药材之间遗传变异大小，并建立道地药材浙玄参的品质鉴定方法。方法运用随机扩增多态性DNA(RAPD)法对产于浙江、山东、湖北的玄参科植物玄参进行了分子标记研究。结果共筛选出9条有效引物，获得142条DNA带，通过聚类分析，构建DNA分子系统树图，确定不同居群间的亲缘关系。结论同种异地药材所形成的不同居群，具有不同的遗传多样性特征。其中浙玄参与山东、湖北玄参存在较大遗传差异，说明浙玄参作为道地药材，具有自身独特的遗传特征。
       【关键词】  道地药材; 玄参; 随机扩增多态性DNA; 聚类分析
       玄参别名元参、黑参、浙玄参，为玄参科植物玄参Scrophulariu ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有滋阴降火、解毒之功效。主产于浙江，另外在山东、湖北、四川、陕西等也有栽培。其中以浙江产玄参为道地药材，为著名的“浙八味”之一。由于该药材品种多、产区广，单纯地依赖形态分类、组织学或化学指纹如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等难以区别[1]。现代分子生物学研究表明，中药材生物资源的多样性是由于其基因多态性导致的[2]。为从基因角度揭示“道地”药材的生物学本质，本文采用RAPD技术分别对来源于浙江、山东、湖北产地的玄参进行遗传多样性研究，旨在为道地药材浙玄参的药材鉴定、栽培繁育、质量评价提供依据。
       1 材料与仪器
       1.1 供试植物材料分别采于浙江临安、湖北恩施、山东青州等地。取新鲜健壮嫩叶置液氮罐中，带回实验室-70℃冰箱中保存。
       1.2 DNA提取试剂提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L β-巯基乙醇。 20%SDS，5 mol/L KAc，10 mg/ml RNaseA， 异丙醇，灭菌水等。
       1.3 PCR试剂10核苷酸随机引物由上海生工生物工程公司合成，共70条(序列编号分别为：S1～S40，S71～S90，S111～S120);DNA聚合酶、Buffer等为MBI公司产品。
       1.4 仪器SIGMA3K-15高速冷冻离心机，PCR仪(Biometra personal，Germany)，琼脂糖电泳仪和凝胶成像系统为上海天能科技有限公司产品。
       2 方法
       2.1 基因组DNA提取方法采用改良SDS法提取基因组[3]，具体操作如下：取1 g叶片，剪碎后加入适量PVP，一起于液氮中研磨成粉。转移粉末到加有500 μl 提取缓冲液的离心管中，轻轻混匀，使粉末充分散开。加入50 μl 20 %SDS溶液，混匀后于65℃水浴中保温10～15 min(间断晃动2～3次)。加入150 μl 5mol/L KAc，混匀，置冰上20～30 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。4℃ 12 000 r/min离心15 min，上清液转入另一离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，-20℃放置30 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀自然晾干后加入50μl TE缓冲液溶解，并加入10 mg/ml RNA酶1 μl ，于37℃保温1 h。电泳检测基因组的完整性。
       2.2 引物筛选及PCR方法[4]首先进行随机引物的筛选，10核苷酸随机引物购自上海生工(编号分别为：S1～S40，S71～S90，S111～S120)，PCR反应体为：10 ×PCR buffer 2.5 μl ，25 mmol/L MgCl2 3μl ，2.5 mmol/L 4dNTP 1.5 μl ，引物(0.5 μmol/L )1 μl ，模板DNA(100 ng)1 μl，Taq聚合酶(5U/ μl ) 0.5 μl ，补加双蒸水至25 μl 。PCR仪的反应条件为：94℃ 预变性 3min，94℃ 变性45 s，36℃退火45 s，72℃延伸1 min，共44个循环，72℃保温7 min。 PCR结束后用1.2%的Agrose进行电泳分析结果。
       2.3 RAPD数据分析[5]按琼脂糖凝胶同一位置上DNA 带的有无进行统计, 有带(包括弱带) 记为“1”, 无带记为“0”。利用NTSYS(2.10e)软件对RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各物种之间的遗传距离，并构建DNA 分子系统树。
       3 结果
       3.1 改良SDS法提取植物基因组DNA植物基因组抽提方法常用的有CTAB法和SDS法，植物中的主要矛盾是粉碎破壁困难和糖类的影响，所以一般采用阳性表面活性剂的方法。最常用的就是CTAB和SDS。但CTAB的表面活性比SDS差，所以本实验采用改良SDS法，其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用异丙醇沉淀。用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测，发现基因组DNA的比较完整(见图1 )。MLamda DNA/EcoRI+HindⅢ1.Genome DNA of Radix Scrophulariae- ZheJiang.Genome DNA of Radix Scrophulariae- ShanDong3.Genome DNA of Radix Scrophulariae- HuBei图1 3种玄参的基因组DNA电泳图谱
       3.2 引物筛选及RAPD分析从70条引物中，共筛选出9条能扩增差异带的有效引物。由S1、S8、S28、S29、S85引物扩增条带(见图2所示)，由随机引物S86、S89、S90、S118扩增的条带(见图3所示)。共扩增出现142个条带，其中多态性条带为83条，占58%。其中以引物S1、S28、S118信号强，特征明显，所筛选的引物序列如表1所示。M1kb DNA Marker1～3.S1 4～6.S8 7～8.S28 10～12.S29 13～15.S85　　1，4，7，10，13.Radix Scrophulariae- ZheJiang2，5，8，11，14.Radix Scrophulariae- ShanDong3，6，9，12，15.Radix Scrophulariae- HuBei　　图2 玄参的RAPD电泳图谱(随机引物：S1、S8、S28、S29、S85)M：1kb DNA Marker1～3.S86 4～6.S89 7～8.S90 10～12.S1181，4，7，10.Radix Scrophulariae- ZheJiang2，5，8，11.Radix Scrophulariae- ShanDong3，6，9，12.Radix Scrophulariae- HuBei图3 玄参的RAPD电泳图谱(随机引物：S86、S89、S90、S118)
       3.3 不同产地玄参的遗传距离分析利用NTSYS(2.10e)软件对RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各物种之间的遗传距离，并构建DNA 分子系统树。遗传距离越大，种间亲缘关系也就越远。遗传距离分析表明，山东玄参和湖北玄参亲缘关系较近，而浙江玄参与二者均较远，说明作为道地药材的浙江玄参具有不同的遗传特征。这与浙江玄参多年的地理、气候、环境等因素有关。表1 筛选出的9条有效引物序列图4 3个自然居群玄参的分子系统树图
       4 讨论
       玄参Scrophularia ningpaensis Heml.生产于长江流域各省，地理分布广，不同地方的气温、土壤、水分等生态因子差别很大，同一种植物在不同的外界环境条件下所形成的大大小小的居群产生了遗传变异。玄参以浙江产量大，品质佳，为著名的“浙八味”道地药材之一。本实验通过遗传距离分析发现，山东与湖北的玄参亲缘关系较近，而道地药材浙玄参与上述两种亲缘关系较远，说明浙玄参在长期的栽培中形成自己独特的遗传特性，这也是多年来以浙玄参为道地药材的原因。
       本次实验是以改良SDS法从新鲜玄参叶片中提取基因组DNA，与传统的CTAB法比较起来，改良SDS法更加简便，所提取的基因组DNA质量较高，完全适合于RAPD等分析。本次实验通过反复多次RAPD分析，成功筛选出9条有效引物，为不同产地或居群的玄参鉴定，以及进一步确定道地药材的SCAR分子标记，建立道地药材浙玄参的种植与质量标准提供科学依据[6]。
       【参考文献】
         　[1] Zhou Y H， Yang J L， Zheng Y L，et al. RAPD study on inter-species relationships in Roegneria[J]. Acta Bot Sin，1999，41:1076.
       
       [2] Wei J Z， Campbell W F， Wang R， et al. Genetic variability in Russian wildrye(psathy rostachys juncea) assessed by RAPD[J]. Genet Resources Crop Evol， 1997，44:117.
       
       [3] 王玲玲， 叶青雷， 王学英，等. 栎属植物DNA提取方法的研究[J]. 沈阳农业大学学报， 2008，39(6):737.
       
       [4] Warude Dnyaneshwar，Chavan Preeti，Joshi Kalpana et al. Development and application of RAPD-SCAR Marker for identification of Phyllanthus emblica Linn[J]. Biol pharm bull， 2006，29(11):2313.
       
       [5] Piyada T， Nantawan K， Duangkamol，et al. Development of species-specific SCAR markers for identification of three medicinal species of phyllanthus[J]. Journal of systematics and evolution， 2008，46(4):614.
       
       [6] Yong-Eui Choi， Chang Ho Ahn， Bo-Bae Kim，et al. Development of species specific AFLP-Derived SCAR Marker for authentication of Panax japonicus C.A.Meyer[J]. Biol pharm bull， 2008，31(1):135.