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       【摘要】 
       目的了解硒和灵芝对免疫系统的影响。方法①质量为18～22 g昆明140只小鼠随机分为7组，其中6组左前腋皮下注射S180，然后分别给予生理盐水、灵芝、富硒灵芝、低硒灵芝、富硒灵芝加环磷酰胺和环磷酰胺处理，未注射S180的一组只给予生理盐水，一周后处死各组动物观察各组脾脏胸腺质量大小、测定血清TNF-α水平变化;②培养EL-4细胞株，分成阴性对照、阳性对照、灵芝、低硒灵芝、富硒灵芝和环磷酰胺组进行淋巴细胞转化实验。结果灵芝能增加胸腺和脾脏质量(P<0.05)，提高T淋巴细胞转化率(P<0.05),少量的硒大大减低血清中TNF-α水平(P<0.05)，大剂量的硒则能升高血清中TNF-α水平(P<0.05)。结论 灵芝能增强小鼠免疫，硒能对小鼠不同的T淋巴细胞群作用不同。
       【关键词】  富硒灵芝; 灵芝; TNF-α; 淋巴细胞转化实验
       Effect of Ganoderma Lucidum and Selenium on Mouse Immune Function
       DAI Jun1,
       WU Shuhui1,
       MA Zhihong1,
       ZHU Zhaoping2,
       WANG Na1,
       SHI Yue1*,
       LIU Hao3
       (1.School of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050091, China; 2.Hebei Provincial People"s Hospital,Shijiazhuang 050051, China; 3.The First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Ganoderma lucidum and Selenium on immune system.
       Methods①140 Kunming mice,weighed 18～22 g,were divided into seven groups at random. The six groups were injected S180 cell line in left front feet and they were given normal saline, Ganoderma lucidum,Ganoderma lucidum rich in Selenium, Ganoderma lucidum which contained the lower dose of Selenium,Ganoderma lucidum rich in selenium plus cyclophosphamide and cyclophosphamide.A week later ,the weights of spleen and thymus in all groups were observed.The evel of TNF-α was detected.②EL-4 cell line was cultured.They were divided into six groups: Ganoderma lucidum group, Ganoderma lucidum rich in Selenium group, Ganoderma lucidum which contains the lower dose of Selenium group, negative control group, positive control group and cyclophosphamide group. Lymphocyte transformation test was carried out.
       ResultsGanoderma lucidum could increase the weights of spleen and thymus(P<0.05)and lymphocyte transformation rate(P<0.05).Lower value of Selenium could also decrease serums TNF-α(P<0.05),but higher value of Selenium could also increase serums TNF-α(P<0.05).
       ConclusionGanoderma lucidum can enhance immune response and Selenium has different effects on different lymphocyte colons.
       Key words:Ganoderma lucidum rich in selenium; Ganoderma lucidum; TNF-α; Lymphocyte transformation test
       灵芝是我国医学宝库中的灵芝属药、食两用真菌，在我国其药用已有二千多年历史，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。大量药理研究也表明灵芝具有免疫、抗衰老、抗肿瘤等作用。其药理作用的产生有的文献[1]报道是由于灵芝中的灵芝多糖能通过膜Ig 和TLR-4 为灵芝多糖激活机体淋巴细胞的免疫受体，TLR-4 也与灵芝多糖激活机体巨噬细胞有关。而硒是某些酶的组成部分[2],在代谢中传递电子，具有调节和促进人体免疫、抗肿瘤、抗氧化等功能。但如果将无机硒给动物服用，其毒性过于强烈，而且其对免疫的刺激功能不如有机硒[3]，而灵芝对硒元素的富集程度较高，我们可以利用灵芝将无机硒转化为有机硒，这样既可提高灵芝中硒元素含量，又有利于人体吸收。而不同硒含量灵芝对免疫调节的机理究竟是怎样呢，对医学实践有何启示，为解决这个问题，我们进行了以下实验。
       1 材料
       1.1 药物与试剂低硒灵芝菌丝体(含硒2 066 ng/ g)、富硒灵芝菌丝体(含硒4 132 ng/ g) 和正常灵芝菌丝体(由课题组自制) 。环磷酰胺(CTX)注射液由上海华联制药有限公司生产(生产批号为071002)。TNF-α ELISA试剂盒(购于渤海生物公司)。RPM1640 购自Gibco 公司。MTT为Sigma 公司产品。PHA (广州医药工业研究所) 。
       1.2 动物昆明小鼠(由河北医科大学动物中心提供)146只，质量为18～22 g，雌雄各半。
       1.3 肿瘤细胞株S180购自河北医科大学动物中心。EL-4细胞株购自渤海生物公司。
       1.4 仪器酶标仪(北京六一仪器厂);微量加样器(SOCOREX,瑞士);电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，离心机(国产)等。
       2 方法
       2.1 建立肿瘤模型选择6只昆明小鼠腹腔接种S180，接种5 d 后的小鼠，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸腹水放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4%台盼蓝染色后计数,在倒置式显微镜下计数，计算存活率，用Hank"s液稀释细胞悬液使活细胞数达到1 ×109个·ml-1，随机选取120小鼠，每只小鼠左前腋皮下注射0.2 ml (活细胞数达到1 ×109个·ml-1)细胞悬液，另外20只小鼠不做任何处理作为正常组。
       2.2 实验动物分组将120只已经注射了S180的小鼠随机分为6组，每组动物各20只，分为阴性对照组、灵芝组、环磷酰胺(CTX)组、低硒灵芝组、富硒灵芝加环磷酰胺(CTX)组和富硒灵芝组。阴性对照组和正常组胃饲生理盐水0.2 ml/(kg·d);环磷酰胺组腹腔注射环磷酰氨0.075 g/(kg·d);富硒灵芝加环磷酰胺(CTX)组给于腹腔注射环磷酰氨0.075 g/(kg·d)，同时胃饲富硒灵芝0.2 g/(kg·d);富硒灵芝组胃饲富硒灵芝0.2 g/(kg·d);低硒灵芝组胃饲低硒灵芝0.2 g/(kg·d);灵芝组胃饲灵芝0.2 g/(kg·d)。
       2.3 实验动物处理以上各组在接瘤24 h 后开始给药,连续给药7 d后，处死动物，取出胸腺脾脏，用电子天平称出胸腺与脾脏质量,计算脏器体重指数。脏器体重指数= 免疫器官的重量(mg) / 体重(g)。同时取血放入肝素抗凝素管内分离血清备用。
       2.4 淋巴细胞转化实验(Lymphocyte Transformation Test,LTT)将生长状态良好的EL-4细胞株离心(800 r/min) 5 min ,用RPM1640 调整细胞密度为每毫升1 ×106个,以每孔1 ml 的量加入24 孔培养板中。实验共分5组,每组设3 个平行孔。其中第1 组为阴性对照组,每孔中加入PHA (终浓度10 mg/L) 后,再加入生理盐水作为对照。第2～4 组为实验组,每孔均加入PHA (终浓度10 mg/L) 后,在这4 组中再分别加入10 μg/L的环磷酰胺、灵芝、低硒灵芝、富硒灵芝。第5组为阳性对照组,每孔加入PHA (终浓度10 mg/L) 后,再加入白介素2( IL - 2) 1 μg/L 。将24 孔培养板于37℃，5 % CO2 孵育箱培养48 h 后, 再加入5 g/L 的MTT 磷酸缓冲液50 μl/孔。3 h 后离心收集细胞, 加入250 μl二甲基亚砜,用酶标仪于波长550 nm 测定光吸收 (A) 值,共进行3 批实验。
       2.5 ELISA法测定各组血清TNF-α水平应用TNF-α ELISA试剂盒(购于渤海生物公司)按说明书测定保存血清中的TNF-α水平。
       2.6 统计学方法均采用SPSS10.0软件，进行t检验。
       3 结果
       3.1 各组脾脏指数如表1所示，阴性对照组、灵芝组及低硒灵芝组之间的脾脏指数无差异(P>0.05);正常组、富硒灵芝组及富硒灵芝加环磷酰胺组之间的脾脏指数无差异(P>0.05);低硒灵芝组大于环磷酰胺组与富硒灵芝加环磷酰胺组(P<0.05);阴性对照组大于正常组与环磷酰胺组(CTX)(P<0.05)。灵芝组大于富硒灵芝组(P<0.05)。
       3.2 各组胸腺指数如表1所示，阴性对照组、灵芝组及低硒灵芝组之间的胸腺指数无差异(P>0.05);正常组、富硒灵芝组及富硒灵芝加环磷酰胺组之间的胸腺指数无差异(P>0.05);低硒灵芝组大于环磷酰胺组与富硒灵芝加环磷酰胺组(P<0.05);阴性对照组大于正常组与环磷酰胺组(CTX)(P<0.05)。灵芝组大于富硒灵芝组(P<0.05)。
       3.3 TNF-α水平如表1所示，环磷酰胺组TNF-α的水平大于任何组(P<0.05);低硒灵芝组小于任何一组(P<0.05);灵芝组大于阴性组和正常组(P<0.05);阴性对照组小于正常组(P<0.05);阴性对照组和富硒灵芝组无差别(P>0.05)。
       3.4 淋巴细胞转化试验如表2所示，从结果可以看出环磷酰胺组、低硒灵芝组与阴性对照组无差别(P>0.05);富硒灵芝组和灵芝组均大于阴性对照(P<0.05)。富硒灵芝组和灵芝组均与阳性对照无差别(P>0.05)。阳性组与阴性组有差别(P<0.05)。表1 各组脾脏和胸腺指数及细胞因子水平表2 各组淋巴细胞转化作用的结果
       4 讨论
       有的文献报道[1]灵芝中的灵芝多糖可通过刺激体液免疫起作用，还有的学者[4]认为TLR4受体与体液免疫应答关系密切，可能通过JAK-STAT途径起作用，我们的实验则显示，灵芝组小鼠的血清TNF-α水平较高，且淋巴细胞转化试验的结果也显示灵芝能刺激小鼠T淋巴细胞系EL-4细胞的增生，这说明灵芝确实能促进TNF-α的产生，而这种作用可能与灵芝促进T淋巴细胞活化有关。但少量的硒元素减弱了这一过程。本次实验结果显示低硒灵芝组的TNF-α水平较低，而且低硒灵芝也未能刺激EL-4细胞增殖。有意思的是，富硒灵芝组的血清TNF-α水平较高，且能刺激EL-4细胞的增生。其原因可能是少量的硒能刺激抑制性T淋巴细胞的增生，所以减少了小鼠血清TNF-α水平，而随着硒元素剂量增加，能刺激的T淋巴细胞种类增加，所以小鼠血清TNF-α水平又增加。
       我们的结果还显示环磷酰胺组的小鼠血清TNF-α水平很高，但环磷酰胺未能刺激小鼠T淋巴细胞系EL-4的增生，这说明环磷酰胺通过直接杀伤肿瘤细胞，使死亡的肿瘤细胞增加，这在很大程度上刺激了机体炎症的发生。
       硒和灵芝刺激免疫的机制是怎样发生的呢，从一些文献[2～5]及本次实验的结果可以看出，灵芝可能活化了T细胞上的TLR4受体后，信号在通过JAK-STAT途径传递过程中，可能硒元素能改变该途径中一些酶的活性，从而导致了传递信号的改变。当然这种改变在抑制性T细胞可能更明显。
       【参考文献】
         　[1] LIU Gao-Qiang，WANG Xiao-Ling.Structure-activity relationship and anticancer mechanisms of Ganoderma lucidum polysaccharides[J].Mycosystema, 2006，25(3)：430.
       
       [2] 韩晓辉,马志红,石玉娥,等.富硒灵芝对D2半乳糖衰老模型大鼠的抗衰老作用研究[J].中药药理与临床，2006，22 (2)：42.
       
       [3] 杜 莹,王晓燕,解 清, 等.富硒蛋白对小鼠免疫功能影响[J].中国公共卫生，2006，22(1)：84.
       
       [4] Angelone DF, Wessels MR, Coughlin M, et al.Innate immunity of the human newborn is polarized toward a high ratio of IL-6/TNF-alpha production in vitro and in vivo[J].Pediatr Res. 2006，60(2):205.
       
       [5] 石玉娥, 李素敏, 王鑫国，等.富硒灵芝菌丝体对小鼠免疫功能的影响[J].中国食用菌，2003，22(5)：45.