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       【摘要】 
       目的观察红花注射液复合黄芪注射液对肠缺血再灌注损伤肠黏膜保护效应。方法采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭45 min后松夹方法制备肠缺血再灌注损伤动物模型。将Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯肠缺血再灌注组及红花注射液复合黄芪注射液治疗组(注射液治疗组，以下同)。假手术组分离SMA但不夹闭，45 min后取血并活杀动物;其余两组分别松夹形成血流再灌注，缺血再灌注组从尾静脉注射0.15 ml生理盐水，注射液治疗组则从尾静脉给予注射液。于再灌注后0.5，0，2，6，12和24 h取血检测血浆D乳酸水平;活杀动物后取小肠组织行苏木素伊红(HE)染色，光镜下观察组织病理形态学改变;观察两组大鼠肠缺血再灌注损伤后不同时间点的存活率。结果与单纯肠缺血再灌注组各时间点比较，注射液治疗组动物存活率均高于对照组，以24 h最为显著，有统计学意义(P<0.05);血浆D乳酸水平于再灌注后1 h则明显低于缺血再灌注组，至24 h仍呈降低趋势(P均<0.05);小肠黏膜病理形态学改变较缺血再灌注组轻。结论红花注射液复合黄芪注射液对肠缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与红花和黄芪抗自由基作用有关。
       【关键词】  红花注射液; 黄芪注射液; 肠缺血再灌注损伤; D乳酸
       在腹部外伤、失血性休克、严重创伤、感染、烧伤等病理状态下,往往存在肠道缺血再灌注损伤和功能障碍,肠屏障功能降低,肠内细菌和毒素通过受损的肠黏膜进入体循环,激活网状内皮系统,引起大量炎症介质和细胞因子释放,造成全身炎症反应综合征(SIRS),甚至发生多器官功能衰竭(MOF)。采取有效措施避免或减少肠道损害有重要作用。本实验中利用大鼠肠系膜上动脉(SMA)夹闭模型,研究全身给予红花注射液复合黄芪注射液对肠道缺血再灌注损伤后肠道的保护作用,探讨其可能的作用机制。
       1 材料与方法
       1.1 动物模型制作及分组选择健康的Wistar大鼠(提供)150只,平均体质量(220±20)g,适应性饲养5 d,手术前12 h禁食,自由饮水。其中78只动物随机分为假手术组(n=6),单纯肠缺血再灌注组(n=36)以及注射液治疗组(n=36)。根据缺血再灌注的时间,又分成0.5，1，2，6，12和24 h等6组,每组6只。采用SMA夹闭致缺血45 min后松夹复制肠道再灌注模型。经腹腔注射质量分数为3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后,在无菌条件下开腹,钝性分离SMA根部。假手术组仅分离SMA根部但不夹闭;其余动物用微血管夹夹闭SMA根部,完全阻断血流45 min,然后松夹,恢复肠道血流形成再灌注。肠缺血再灌注组和注射液治疗组分别于SMA夹闭45 min后松夹,即刻从尾静脉注射生理盐水(0.15 ml)或红花注射液和黄芪注射液(每只黄芪注射液0.6 ml·kg-1合红花注射液1 ml·kg-1混匀注射)进行预处理。取静脉血,离心后分离血浆, 70℃低温保存待测。按设定时间点活杀动物,取距离回盲部上端10 cm以上的肠管,用体积分数为10%的中性甲醛固定,石蜡包埋,4℃保存待用。另72只大鼠予以同等程度肠缺血再灌注损伤处理,观察大鼠存活情况。
       1.2 观察指标及方法
       1.2.1 观察肠缺血再灌注损伤后大鼠存活情况72只大鼠予以肠缺血再灌注损伤处理后,于再灌注2，6，12，24和48 h各时间点观察大鼠存活情况。
       1.2.2 血浆D乳酸检测以改良Brandt方法[1]测定血浆D乳酸浓度。
       1.2.3 肠道组织学检查取经10%中性甲醛固定、石蜡包埋的小肠组织切片,苏木素伊红(HE)染色,光镜下观察小肠组织病理学变化。小肠损伤程度用Haglund等[2]报道的积分法评估。0分为正常绒毛和腺体;1分为部分绒毛顶部上皮轻度受损;2分为上皮下腺体轻度受损;3分为上皮下间隙扩大,毛细血管充血;4分为上皮与固有层中度分离,腺体受损;5分为部分绒毛顶部脱落;6分为绒毛脱落明显,毛细血管扩张;7分为固有层绒毛脱落,腺体受损明显;8分为固有层开始消化分解;9分为出血、溃疡。
       1.3 统计学方法 χ2检验比较注射液治疗组与肠缺血再灌注组间大鼠存活率的变化。血浆D乳酸浓度检测结果及小肠损伤程度积分以±s表示,采用完全随机设计资料方差分析,用q检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
       2 结果
       2.1 肠缺血再灌注后大鼠存活率结果见表1。注射液治疗组各时间点动物存活率均高于肠缺血再灌注组,其中24 h组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。表1 注射液对肠道缺血再灌注后大鼠存活率的影响
       2.2 血浆D乳酸浓度水平变化结果见表2。肠道缺血性损伤可使血浆D乳酸水平明显升高,与缺血前相比,有显著性差异(P<0.01)。肠道缺血再灌注损伤后0.5 h时即已出现血浆D乳酸水平明显升高,随时间延长,血浆D乳酸水平逐步升高,于肠缺血再灌注12 h达高峰,以后逐渐下降,24 h已恢复高峰值的1/2以下,但仍然高于缺血前的血浆D乳酸水平。与肠缺血再灌注组比较,注射液治疗组肠缺血再灌注0.5 h时,血浆D乳酸水平比肠缺血再灌注组高,随再灌注时间延长,注射液治疗组血浆D乳酸水平明显降低。两组间比较有显著性差异(P<0.05)。提示注射液治疗组有明显减轻肠道再灌注损伤作用。
       2.3 肠道组织病理学变化光镜下见假手术组肠道黏膜细胞排列基本整齐,结构完整,无组织坏死、缺失及水肿。肠缺血再灌注组可见小肠黏膜上皮下间隙扩大,腺体受损及毛细血管充血、水肿,再灌注1～2 h肠道组织出现部分肠绒毛脱落、炎细胞浸润,6 h有大量绒毛脱落、糜烂、炎性细胞浸润、肠道组织结构破坏。注射液治疗组各时间点病理损伤较肠缺血再灌注组减轻。各组小肠缺血再灌注损伤程度积分比较见表3。表2 注射液对肠缺血再灌注后大鼠血浆D乳酸水平的影响表3 注射液对缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜损伤程度的保护作用
       3 讨论
       实验结果表明,肠道缺血再灌注损伤对消化道局部造成损害,大体标本可见肠道充血、水肿、出血、坏死,肠腔内可见糜烂、出血、溃疡;常规HE染色病理切片可见肠绒毛毛细血管扩张、淤血,肠腺上皮细胞水肿、坏死、脱落。由于肠绒毛缺血坏死、脱落、通透性增加,肠道屏障功能大大降低,表现为肠道细菌特有代谢产物D乳酸进入体循环,使血浆D乳酸水平成倍地升高。D乳酸是肠道内细菌发酵产生的一种物质,哺乳动物组织不产生D乳酸,且缺乏代谢该物质的酶系统,不能代谢该物质。在肠道屏障功能正常时,血浆D乳酸水平极低,只有当肠屏障遭受破坏时,D乳酸透过肠屏障入血,使血浆D乳酸快速升高。因此,血浆D乳酸水平可间接反映肠道屏障功能好坏,可作为肠道损伤指标之一。本结果显示,肠道缺血再灌注损伤后0.5 h,血浆D乳酸水平即明显升高,再灌注6 h时成倍升高,12 h达到高峰,以后逐步下降恢复。血浆D乳酸水平变化曲线与光镜下所见肠黏膜上皮结构破坏严重程度一致。由于肠道内细菌和毒素可经过受损伤的肠屏障入体循环,刺激网状内皮系统,引起大量炎症介质和细胞因子释放,因此易导致多器官功能障碍综合征(MODS),表现为肠缺血再灌注损伤后,动物存活率明显下降。本组再灌注损伤后12 h动物存活率为53%,24 h降为25%,48 h仅为14%。
       研究表明，失血再灌注后产生大量氧自由基导致组织氧化损伤是肠黏膜损伤的重要机制。在缺血期,肠黏膜中丰富的黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,腺苷酸分解代谢为次黄嘌呤,细胞ATP耗尽,导致ATP依赖的离子通道调节失效,使K+和Mg2+扩散出细胞,Na+、Ca2+、水进入细胞,引起细胞水肿。再灌注期,氧随着血流的恢复进入缺血组织,在黄嘌呤氧化酶的作用下次黄嘌呤与氧分子作用生成黄嘌呤,最终生成尿酸。在这一过程中释放大量的氧自由基。在生理情况下，氧自由基可通过相互碰撞而猝灭， 也可与生物体内一些天然自由基清除剂或抗氧化剂作用，从而终止连锁反应。 当机体缺血再灌注过程中， 自由基产生过多或酶性保护系统等活性低下、抗氧化作用下降，即可引发脂质过氧化损伤[3]。
       红花注射液复合黄芪注射液给予后,早期可一过性加重肠道缺血再灌注损伤,表现为注射液组的血浆D乳酸水平高于对照的肠缺血再灌注组〔(0.465±0.065)mmol/L比(0.332±0.100)mmol/L〕，其机制可能与红花注射液与黄芪注射液的舒血管活性作用有关。红花具有明显扩张外周血管、冠状血管、脑血管和肠血管的作用。由于缺血后再灌注和红花扩血管共同作用,使肠道微血管床大量开放,使氧供剧增,通过肠道富含的黄嘌呤和次黄嘌呤氧化酶系统产生大量的氧自由基,加重肠黏膜损伤。但随着再灌注时间的延长,红花注射液复合黄芪注射液可明显减轻大鼠缺血再灌注损伤,24 h动物存活率上升至47%;而血浆D乳酸水平则明显降低。光镜下肠上皮黏膜组织结构损伤程度减轻。其机制可能与红花注射液复合黄芪注射液清除自由基作用有关。王海华[4]、张灼等[5]分别应用大鼠离体工作心脏模型研究黄芪注射液、黄芪皂苷对心肌缺血再灌注损伤的影响，结果发现黄芪注射液预处理对大鼠离体心肌再灌注损伤有明显保护作用，与非创伤性肢体缺血预处理的保护作用相似。黄芪皂苷能改善再灌注后心脏血流动力学的变化， 且有显著的扩冠作用。 两者均能提高心肌组织中 SOD活性，减少心肌组织中的脂质过氧化物，增强心肌的抗氧化能力、 稳定心肌的膜相结构。 体内实验研究发现黄芪预处理不仅能够保护细胞中 SOD酶活性和超微结构，而且能诱导心肌细胞热休克蛋白 HSP70的表达，从而减少缺血再灌注心肌损伤[6]。徐持华[7]等研究了红花黄色素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用,实验结果显示,红花黄色素能使各种内源性抗氧化酶(SOD、谷胱甘肽过氧化物酶)不同程度的升高,降低脂质过氧化反应的发生,减少脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成,减少缺血心肌自由基生成并阻止自由基损伤。红花注射液复合黄芪注射液对小肠缺血再灌注损伤的保护作用也可能是类似的机理，值得进一步研究。
       【参考文献】
         　　[1] Qin Renyi,Zou Shengquan,Wu Zaide,et al.Influence of splanchnic vascular infusion on the content of endotoxins in plasma and the translocation of intestinal bacteria in rats with acute hemorrhage necrosis pancreatitis[J].World J Gastroenterol,2000,6:577.
       
       [2] Haglund U,Osterberg J.Local consequences of reperfusion in gut. In:Pierce A,Robert T.Ischemia reperfusion injury[M].Oxford UK:Blackwell Science,1999：65.
       
       [3] 丘瑞香,贺敬波,蓝 军,等.中药复方心脉通胶囊的抗心肌缺血疗效与机制[J].中山大学学报(医学科学版),2001,22(1):57.
       
       [4] 王海华,戚仁斌,殷慧群,等.黄芪预处理对离体心脏再灌注损伤的保护作用[J].中药药理与临床,2001,17(4):21.
       
       [5] 张 灼,陈立新,秦腊梅,等.黄芪皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤血流动力学和氧自由基的影响[J].中国中医药信息杂志,2000,7(3):7.
       
       [6] 程桂荣,易胜中.黄芪预处理大鼠心肌保护效应的实验研究[J].高血压杂志,2001,9(4):316.
       
       [7] 徐持华,张善峰,马二民.大鼠心肌缺血再灌注损伤与红花黄色素的保护作用[J].中国临床康复,2005,9(43):93.