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       【摘要】 
       目的通过正交实验研究中药水蛭中抗凝血酶活性物质提取的最佳工艺。方法采用正交实验设计法，以提取温度，生理盐水用量，提取次数和提取时间为考察因素，每个因素设计3个水平进行实验。以测得的水蛭素含量和蛋白质含量计算出水蛭素的比活力做为评价指标进行正交实验。结果最佳提取工艺为：15倍溶剂量，温度为70℃，提取时间为30 min，提取次数为两次。结论该方法可为中药水蛭中抗凝血酶活性物质的提取提供依据。
       【关键词】  水蛭素; 蛋白质; 正交实验; 提取工艺
       水蛭是传统的破血逐瘀药，始载于《神农本草经》，《中国药典》2005年版收载了水蛭Hirudo nipponica Whitman，蚂蝗Whitmania pigra Whitman和柳叶蚂蝗W.acranulata Whitman 3种[1]。水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面有着很强的生物活性，其中水蛭素是迄今为止发现的最强的凝血酶抑制剂之一。在中国水蛭临床用药多为炮制品，其炮制方法多样，质量各异，标准不一。经过调查，市售的炮制品水蛭多为开水烫制水蛭(清水水蛭)和滑石粉炒制水蛭，然而随着研究的不断深入，越来越多的学者认为生用效果更佳[2]，所以本实验采用风干的生水蛭也就是吊干水蛭进行研究。
       正交实验设计可以用较少的、有代表性的处理组合数提供充分有用的信息，与普通的多因素试验设计相比，它在分析主效应与交互作用的同时大大减少了样本量及实验次数，是一种高效、灵活的多因素试验设计方法，因此被广泛应用于科学研究中。目前对水蛭抗凝血活性物质提取的报道特别是对提取工艺研究的报道较少，为了有效地开发和利用药材资源，充分提取水蛭中抗凝血活性成分，本实验采用正交实验的方法对传统提取方法进行了改进，确定了生理盐水提取水蛭中抗凝血酶活性成分的最佳提取工艺，为水蛭资源的开发和抗凝血物质的提取提供科学依据。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器FA2004型电子天平(万分之一，上海恒平仪器有限公司)，TGL-16M型高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)，HHZ-4型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)，微量移液器(DRAGON-MED)，Spe-54型双光束紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司)。
       1.2 材料水蛭药材购于河北安国中药材市场(经佳木斯大学药学院生药学教研室刘娟教授鉴定为蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体)。
       1.3 试剂凝血酶(Thrombin，苏州新宝制药有限公司，规格：500 IU，批号：H32020891);(牛)纤维蛋白原(Fibrinogen，SIGMA，F8630-200mg，凝固物含量为75%);牛血清白蛋白(BSA，SIGMA，A730-5g，98%);Tris碱、盐酸、生理盐水、硫酸铜、酒石酸钾钠均为国产分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 溶液的制备根据相关文献资料和预试验[3]，取水蛭干燥全体用锉刀锉成细粉，称取水蛭细粉9份，每份2.0 g。以生理盐水为提取溶剂，以提取次数、提取温度(℃)、提取时间(min)和提取溶剂倍量为考察因素，每个因素选择3个水平，以测得的水蛭素的含量和蛋白质的含量计算得出的水蛭素比活力作为考察指标。选用L9(34)正交表进行实验，对中药水蛭中水蛭素的提取工艺进行研究，并对结果进行方差分析和显著性检验。各因素及水平见表1，正交实验设计方案及结果见表2。
       2.2 水蛭素活力的测定 精密量取提取液上清液100 μl，置试管(20 mm×10 mm)中，加入含0.5%牛纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液200 μl，摇匀，置37℃水浴中预温2 min。缓缓滴加20 IU·ml-1的凝血酶溶液(每1 min不超过5 μl，也就是0.1 IU的凝血酶)，边滴加边轻轻摇匀，至出现丝状凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积。按下式计算抗凝血酶活性(U):U=20(IU·ml-1)×V(ml)×W/0.1(ml)。其中，V为消耗凝血酶溶液的体积，W为提取液总量[4]。
       2.3 蛋白质含量测定
       2.3.1 标准曲线的绘制取一系列试管，分别加入牛血清白蛋白标准溶液(5.860 mg·ml-1)0，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6 ml，用蒸馏水补足至2 ml，分别加人4 ml双缩脲试剂在室温下放置30 min，置于540 nm波长处比色，测得吸光度值分别为0，0.112，0.225，0.338，0.477，0.601，以吸光度(A)为纵坐标，牛血清白蛋白含量(C)为横坐标绘出标准曲线，以最小二乘法得其线性方程为A=46.880 3×10-3C+2.5523×10-3，r= 0.999 8，表明在此浓度范围内有良好的线性关系。
       2.3.2 双缩脲试剂的配制 取硫酸铜试剂(CuSO4·5H2O)1.5 g和6 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)溶于500 ml蒸馏水中，再加入300 ml10%的NaOH溶液并不断搅拌，用蒸馏水定容至1 000 ml容量瓶中，放冷待用。
       2.3.3 双缩脲比色法测水蛭提取液中蛋白质含量精密量取水蛭提取液2 ml，分别加人4 ml双缩脲试剂后在室温下放置30 min，置于540 nm波长处比色，测定其吸光度值。代入线性方程，计算蛋白质含量，进而得出水蛭提取液中蛋白质的总含量。
       2.4 水蛭素比活力的计算根据所测得的水蛭素活性与蛋白质含量就可以计算出水蛭素的比活力，计算公式为：水蛭素比活力(ATU·mg-1)=水蛭素总量(ATU)/蛋白质总含量(mg)。表1 因素水平
       2.5 实验结果以水蛭素含量和蛋白质含量来计算水蛭素比活力为综合评价指标，采用SPSS13.0数据处理系统进行方差分析。由表2可知因素C的极差最小，也就是对本试验的影响最小，所以以此项为误差项进行方差分析。结果见表3。
       根据正交实验结果、直观分析及方差分析结果可见各因素对水蛭素得率影响的顺序为：A>B>D>C。由表3可知，A和B两项因素的P值小于0.05，对实验结果影响显著，因素D的P值大于0.05，说明因素D对实验因素影响不显著。因此因素A和B为主要因素，D和C因素为次要因素。因此，本实验的最佳的提取工艺为：A3B3D2C2，即在70℃，15倍剂量的条件下提取两次，每次30 min为最佳的提取工艺。　　表2 L9(34) 正交实验方案及结果
       3 讨论
       通过本实验的研究表明，合理地利用正交实验不仅省时、省力，还可以达到很好的实验效果。使用SPSS统计软件包对L9(34)正交实验结果进行数据处理，只要按正交表的设计格式输人实验数据，便可获得所需的统计结果。其操作方便、直观、快捷，结果准确。此法也可用来处理其他正交实验的数据。表3 方差分析结果
       以往的文献报道多以提取物总氮提取率、水蛭素含量或抗凝血作用作为提取工艺筛选的考察指标，但往往都是不够全面或敏感性太低。为此，本实验以测得的水蛭素含量结合水蛭提取液中蛋白质的含量计算出水蛭素的比活力作为考察指标对提取工艺进行了优化。结果表明，在70℃下，以15倍剂量的生理盐水分两次提取，每次30 min可获得较好的提取效果。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：57.
       
       [2] 刘丽芳，金蓉鸾，徐国钧，等.中药水蛭经炮制后成分变化研究[J].中成药，2001，23(13):880.
       
       [3] 董晓云，饶高雄，林亚明，等.以抗凝血活性指标筛选水蛭的提取工艺[J].云南中医学院学报，2002,25(3):23.
       
       [4] 文洪宇，李 洪，陈媛媛，等.酒火炙水蛭的生物活性考察[J].中国药房，2007，18(18)：1372.