文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的优化[bmim]Br 水溶液作为溶剂时提取土茯苓总黄酮的工艺条件。方法采用微波辅助提取技术，以土茯苓总黄酮提取率为指标，考察pH值、提取时间、微波功率、提取液浓度和固液比对土茯苓总黄酮提取率的影响。结果土茯苓总黄酮提取最佳条件为：提取剂[bmim]Br水溶液浓度为1.0 mol/L，最佳pH为9，最佳固液比为1∶20，微波功率为500W，提取温度为70℃，萃取10 min，其粗黄酮的得率为13.9mg/g。结论与传统的乙醇提取方法相比，该方法使用的溶剂量少，微波功率低，快速高效，环境友好，且提取率高。
       【关键词】  离子液体[bmim]Br; 土茯苓; 黄酮; 微波辅助提取
       离子液体，又称室温离子液体(Room Temperature Ionic Liquid，RTIL)或室温熔融盐。它是在室温及邻近温度下完全由离子组成的液体物质[1]。离子液体由于其独特的优点而受到越来越多的关注，如熔点、黏度、密度以及溶解能力都能通过改变离子液体的结构而得到调整[2]。另外，离子液体中无分子存在，还具有蒸气压低，不挥发，不易燃，毒性小，导电性强，溶解能力强，在300℃以下能稳定存在[3]等优点，因而在电化学、化学反应、分析化学和分离过程等领域都具有广阔的应用前景。
       最近研究表明离子液体体系萃取条件温和，适合于生物分子和易乳化体系的分离。Smironva等[4]以DCH18C6为萃取剂，考察了[C4mim][PF6]体系中氨基酸的萃取过程，即使对于亲水性强的甘氨酸，其萃取率亦能达到95%。刘庆芬等[5]在利用疏水性离子液体[C4mim][PF6]萃取青霉素的基础上，又研究了由亲水性离子液体[C4mim][BF4]和NaH2PO4形成的双水相体系萃取青霉素的新方法，萃取率可达93.7%。由于萃取过程中pH值在4.05～4.72弱酸范围内，可以有效避免传统有机溶剂乙酸丁酯萃取时青霉素易降解破坏和乳化严重的现象。
       在微波辅助萃取(MAE)中草药中有效活性成分时，萃取溶剂需要有一定的极性才能吸收微波进行内部加热，通常选用极性较强的溶剂或者是极性溶剂和非极性溶剂的混合液，如甲醇、乙醇、二氯甲烷-甲醇、水-甲苯等。但这些挥发性有机溶剂在样品前处理过程中会引起环境污染。离子液体非常适合做MAE萃取溶剂，因为离子液体是由离子组成的，具有蒸气压低、挥发性小、溶解能力强、萃取能力好、液态范围宽等独特的物理化学性质，同时对微波具有强的吸收和热转换能力。离子液体作为一种可设计的绿色溶剂广泛应用在液液萃取、液相微萃取、固相微萃取、膜分离和双水相萃取等样品预处理方面。与有机溶剂相比，离子液体做溶剂可以减少萃取分离过程中的环境污染，但在常温下离子液体的黏度较大，扩散能力较差，难以直接应用于中草药等固体基质中有效成分的萃取分离[6]。通过添加共溶剂或者升高温度，可以显著降低离子液体的黏度，提高溶剂的扩散能力，而离子液体仍能保持好的溶解和萃取能力。文献报道离子液体溶液可作为MAE溶剂[1，7]萃取中药材中有效活性成分。
       土茯苓的化学成分含有水溶性生物碱，甾体皂苷(如β-谷甾醇)、黄酮类及色素的混合物，此外还含有多糖、单宁、微量挥发油及淀粉等[8，9]，经研究发现，土茯苓黄酮类化合物主要为黄酮类，极性较大。因此，本文采用土茯苓作为研究对象，研究极性的离子液体作为提取溶剂在提取土茯苓黄酮类化合物中的作用。
       1 仪器与试剂
       XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)，DZF-6020型真空干燥箱(巩义予华仪器有限公司)，Seveneasy pH计(Mettler Toledo)，EL204电子天平(Mettler Toledo)， UV-2450型紫外分光光度计(SHIMADZU)。
       N-甲基咪唑(临海市凯合化工厂);溴代正丁烷(上海化学试剂采购供应五联化工厂);醋酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司);芦丁(Rutin)对照品(中国药品生生物制品检定所提供，批号0080-9705);土茯苓(购于三九中药店，经湖北中药研究院王克勤研究员鉴定为百合植物光叶菝契);整个实验过程均采用二次蒸馏水。
       2 方法
       2.1 溴化1-丁基-3-甲基咪唑([bmim]Br)的合成在100 ml的圆底烧瓶中，加入13.12 g(约0.16 mol)的N-甲基咪唑，然后在超声环境下用滴管将24.08 g(约0.176 mol)溴代正丁烷缓慢加入甲基咪唑中[10]，加料过程约10 min;将烧瓶放入微波炉反应器中，接好冷凝回流装置，微波功率选择500 W，温度80℃，间歇式加热，加热时间为每次30 s共7次，每次停止加热后，振荡摇匀，使反应物均匀分散在体系中。反应结束后冷却到室温，得到淡黄色黏稠液体[bmim]Br，得到的初产品用20 ml去离子水稀释，将水溶液倒入60 ml分液漏斗中，用5 ml醋酸乙酯洗涤5次。取出下层水溶液，70℃旋转蒸发除去水，剩余物质在70℃下真空干燥8 h，得到淡黄色黏稠液体，密封放入冰箱中冷冻，得到产品34.130 7 g，收率为91.77%。
       2.2 土茯苓黄酮类化合物的萃取将土茯苓饮片粉碎、过筛，得到粒径为30～60目的样品。准确称取0.5 g粒度为30～60目的土茯苓样品于100 ml圆底烧瓶中，加入10 ml [bmim]Br水溶液，调整pH值为9左右，放入搅拌子，在70℃，微波功率为500 W下萃取 10 min，取出冷却后测量。
       2.3 分析方法总黄酮的分析采用紫外-可见分光光度法，以芦丁为对照品，试样中加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，可直接进行分光光度测定。
       3 结果与讨论[11]
       3.1 固液比对提取效果的影响采用0.5 mol·L-1的离子液体，在微波功率为600 W， 提取时间为5 min的条件下，研究固液比对提取液中黄酮总量的影响。土茯苓质量为 0.5 g。结果如图1所示。随着固液比的增加，提取液中黄酮总量在逐渐增加，这是因为增加提取剂的用量，会有利于黄酮的溶出。但固液比大于1∶20后，提取液中黄酮总量基本不变，这说明再继续增加溶剂的用量，也不会增加黄酮的溶出总量，反而加大了溶剂的成本，所以在以后的提取实验中，采用的固液比均为1∶20。图1 固液比对提取黄酮总量的影响
       3.2 pH值对提取效果的影响采用10 ml 0.5 mol·L-1的离子液体对0.5 g土茯苓进行提取。在微波功率为600 W，提取时间为5 min的条件下，研究提取液的pH值对提取液中黄酮浓度的影响。结果如图2所示。随着pH值的逐渐升高，提取液中黄酮浓度也逐渐增加，当提取液在弱碱性(pH为9左右)条件下时提取效果最好。这是因黄酮类化合物显酸性，可溶于弱碱性溶液。但碱性过强，黄酮类化合物易水解，不稳定，因此，通过调节溶液pH后，可明显提高离子液体对土茯苓总黄酮的提取效果。图2 pH值对提取效果的影响
       3.3 提取温度对提取效果的影响采用10 ml 0.5 mol·L-1的离子液体对0.5 g土茯苓进行提取，调节提取液pH值为9，在微波功率为600 W，提取时间为5 min的条件下，研究提取液温度对提取液中黄酮浓度的影响。从图3中看出，随着提取温度的提高提取液的浓度逐渐增大，当温度达到70～80℃时，提取液浓度最大。随后，继续提高提取温度，提取液中黄酮的含量有少许下降，这可能是因为，当温度过高时会导致有部分黄酮类物质分解。因此最后选择最佳提取温度为70℃。图3 提取温度对提取液中黄酮浓度的影响
       3.4 提取时间对提取效果的影响采用10 ml 0.5 mol·L-1的离子液体对0.5 g土茯苓进行提取。在微波功率为600 W，提取温度为70℃的条件下，研究提取时间对提取液中黄酮浓度的影响。结果如图4所示。在2～10 min时间范围内，提取液中土茯苓黄酮的浓度随时间的延长而有明显的增大;但当提取时间超过10 min时，提取液中黄酮的浓度反而有少许下降。这可能是因为微波加热的升温有个过程，在2～5 min以内，黄酮的溶出速度主要是受热的控制，因此温度升高很快，所以黄酮的溶出速度也很快，但当时间达到5 min后，温度恒定在70℃，大部分细胞膜被破坏，此时黄酮的溶出速度主要受扩散速度的影响，因此，此时提取液中黄酮浓度增加速度变缓;但当微波照射时间超过10 min，由于微波的强热效应，对土茯苓总黄酮有分解作用，导致了提取液中总黄酮浓度有少量下降。因此，提取时间宜在10 min左右。　　图4 提取时间对提取液浓度的影响
       3.5 功率对提取效果的影响采用0.5 mol·L-1的离子液体，在固液比为1∶20，萃取时间为5 min，萃取温度为70℃条件下，研究微波功率对提取液中黄酮浓度的影响。实验发现，当微波功率较低时(400 W)，萃取液的温度升高很慢，萃取温度虽然设定的是70℃，但开始加热前2 min，萃取液的温度并没有达到70℃，因此提取效率不高;但当微波功率较高时(600 W和700 W)，萃取过程中，温度升高过快，以至于萃取液的温度不容易控制，很容易超过70℃，而温度过高会导致部分黄酮水解，不利于黄酮的提取;因此最后采用微波提取功率为500 W。见图5。图5 微波功率对提取效果的影响
       3.6 离子液体的浓度对提取率的影响在固液比为1∶20，萃取时间为10 min，萃取温度为70℃，微波功率为500 W的条件下，研究提取液浓度对提取液中黄酮浓度的影响。结果如图6所示。当[bmim]Br浓度从0逐渐增加到1.0 mol·L-1，黄酮的萃取量明显增加，在离子液体浓度达到1.0 mol·L-1时，黄酮的萃取率达到最大，但继续增大提取液的浓度，提取液的黏度会明显增大，不利于实验操作，而且其提取液中黄酮的含量也趋于稳定。因此，从萃取成本及操作方便程度考虑，最终选择1.0 mol·L-1 [bmim]Br溶液作为微波辅助提取土茯苓总黄酮的溶剂。图6 提取液浓度对提取效率的影响
       3.7 离子液体和乙醇对土茯苓中总黄酮萃取的比较根据本课题组前期的工作可知，采用60%乙醇为溶剂萃取土茯苓中总黄酮具有较好的效果。因此本文在前期工作的基础上[12]，分别采用1.0 mol·L-1 [bmim]Br溶液和60%乙醇溶液做萃取剂，在各自最优条件下，利用微波辅助萃取法分别萃取土茯苓中总黄酮，所得萃取液分别用1.0 mol·L-1 [bmim]Br溶液和60%乙醇作为参比，用紫外分光光度法测定其黄酮的含量，结果发现，采用1.0 mol·L-1[bmim]Br萃取的溶液总黄酮含量比60%乙醇萃取的溶液黄酮含量高，且其总黄酮的得率分别为13.9 mg·g-1和8.67mg·g-1，这说明1.0 mol·L-1 [bmim]Br水溶液的提取能力优于60%的乙醇水溶液。
       4 结论
       以离子液体[bmim]Br水溶液为溶剂，研究了[bmim]Br水溶液微波辅助提取土茯苓中黄酮类化合物。结果表明：1.0 mol·L-1 [bmim]Br溶液为溶剂，当pH值为9左右，固液比为1∶20，微波功率500 W，在70℃时微波辅助萃取10 min，其总黄酮的得率为13.9 mg·g-1。
       与本课题组前期的工作比较，发现离子液体微波辅助提取土茯苓黄酮的最佳固液比(1∶20)要大于传统有机溶剂乙醇微波提取的固液比(1∶30)，这说明以离子液体溶液作为提取剂，减少了溶剂的使用量;
       从对比实验结果可以看出，以[bmim]Br水溶液为萃取剂的提取效果优于60%乙醇的提取效果，但由于前者采用的是水溶液，因此，在提取过程中易将水溶性的多糖和胶质等杂质也同时溶入提取液中，因此可能会对后续的分离产生影响，其结果还有待进一步的研究。
       【参考文献】
         　[1] Berthod A, Ruiz- A ngel M J, Carda-Broch S.Ionic liquids in separation techniques[J].J. Chromatogr. A, 2008, 1184(1): 6.
       
       [2] Xiang Z Y, Lu Y C, Zou Y, et al. Preparation of microcapsules containing ionic liquids with a new solvent extraction system[J].Reactive & Functional polymers, 2008：1260.
       
       [3] Du F Y, Xiao X H, Li G K. Application of ionic liquids in the microwave-assisted extraction of trans-resveratrol from Rhizma Polygoni Cuspidati[J]. J. Chromatogr. A., 2007, 1140(1): 56.
       
       [4] Smirnova S V, Torocheshnikova I I, Fornanovsky A A, et al.. Solvent extraction of amino acids into a room temperature ionic liquid with dicyclohexano-18-crown-6[J]. Anal. Bioanal. Chem., 2004, 378(5):1369.
       
       [5] 刘庆芬，余 江，王佳玉，等. 离子液体分离萃取青霉素的方法[P]. 中国专利: CN20041009007. 6，2005-01-12.
       
       [6] 杜甫佑，肖小华，李攻科.离子液体微波辅助萃取石蒜中生物碱的研究[J].分析化学，2007，35(11)：1570.
       
       [7] Hoffmann J, Ntchter M, Ondruschka B, et al. Ionic liquids and their heating behaviour during microwave irradiation- a state of the art report and challenge to assessment[J]. Green Chem., 2003, 5(3): 296.
       
       [8] 袁久志，吴立军，陈英杰，等.土茯苓化学成分的分离与鉴定[J].中国药物化学杂志，2004，14(5):291.
       
       [9] 邱光清，许连好，林洁娜，等.土茯苓总皂苷的抗肿瘤作用研究[J].中药药理与临床，2001，17(5) :14.
       
       [10] 许建勋.咪唑类离子液体合成及其应用研究[J].化工技术与开发，2004，33(4)：15.
       
       [11] 田 君，池汝安，高 洪，等.乙醇提取土茯苓黄酮苷的动力学研究[J].天然产物研究与开发，2005，17(1)：11.
       
       [12] 刘 俊，黄少伟，张越非，等.微波辅助提取土茯苓总黄酮[J].中药材，2007，30(12)：1591.