利用吸附法从八角中提取分离莽草酸的研究
作者：黄芳芳， 苏小建*
作者单位：(广西师范大学环境与资源学院，广西 桂林 541004)
《时珍国医国药》 2010年 第8期
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【摘要】
目的建立一种快速高效提取分离八角中莽草酸的方法。方法采用吸附法，以水为溶剂，循环提取八角3次，料液质量比分别为1∶8，1∶7和1∶6，提取时间第1次为3 h，后两次都为2 h，合并3次提取液，再分别用硅胶吸附和两种碱性阴离子交换树脂吸附的方法从八角水提取液中分离纯化莽草酸。结果挥发油得率为6.534%，硅胶和碱性阴离子交换树脂对莽草酸都具有一定的吸附作用，但强碱性阴离子交换树脂201×4的分离纯化效果最好，莽草酸的含量达到91.59%，得率为2.76% 。结论该方法简便易行，可作为从八角中提取分离莽草酸的方法。
【关键词】 八角; 莽草酸; 吸附法
八角Illicium verum Hook.f. 别名大料、五香八角、八角茴香、大茴香，是八角科植物八角茴香的干燥成熟果实，原产亚洲东南部和美洲，现主要产于我国的广西、广东和云南等南方省区和东南亚[1]。八角早在四、五百年前的明代时就有人工栽培，是一种重要的辛香料，全球90%的八角茴香产于中国[2]。八角性味辛温，有香气，它除了被普遍用作香料外，还是一种具有抗炎、镇痛之效的中药。中医学表明，八角具有温阳散寒、理气止痛的功效，用于寒疝腹痛、肾虚腰痛、胃寒呕吐、腰腹胀痛[3]。除作为调味品外，八角用于制造甜香酒、啤酒等食品工业，也是制造牙膏、香皂、香水、化妆品的香料;还是合成一些化合物的原料，也用于采水晶矿工业上[4]。目前我国八角消费大约95%用作香料，5%作为药物使用[5]。八角作为我国的传统植物，有着较为悠久的栽培历史，但因其在很长一段时期里都作为一种调味品，药用价值得不到体现，故其有效成分一直未引起国人的注意和研究。近年来，在八角中发现了一种重要的成分——莽草酸(Shikimic acid)，是对抗禽流感药物达菲的合成原材料[6]。其结构式见图1。
瑞士罗氏药厂利用莽草酸为原料合成达菲，它能有效治疗禽流感。现代药理学研究证明，莽草酸具有较强的镇痛和抑制血小板聚集作用[7，8]。莽草酸虽存在于大量高等植物或微生物中，但由于八角科植物的果实中含有较大量的莽草酸，在八角的甲醇提取液中能达含有超过10%的莽草酸，所以被作为提取莽草酸的植物资源[9]。目前莽草酸比较受到关注的发展前途有二：一是抗菌抗肿瘤作用;二是对心血管系统的作用[6]。由于莽草酸的药理作用和在医药方面的良好的发展前景，使得八角引起了国内外医药界的高度关注。图1 莽草酸(Shikimic acid)的结构式
现有莽草酸的生产方法主要是采用传统的有机溶剂提纯法,这一生产工艺存在工艺过程冗长,溶剂耗量大,溶剂种类多,成本高,工作效率低等不足。离子交换法作为一种现代分离技术已得到了广泛应用,采用此法仅用少量溶剂洗脱离子交换树脂就能达到浓缩分离的目的,溶剂用量大为减少,且离子交换树脂可再生利用,成本相对较低,因此离子交换法具有独特的优越性[10]，在提取八角茴香油的同时提取出莽草酸，实现了资源的综合利用，降低了八角深加工产品开发的成本。与其它提取莽草酸的工艺相比，该工艺的流程相对简便，制备时间较短，耗材较少。同时对新工艺的研究有利于加快工艺提取的速度、减少能耗，更能提高八角的综合利用率而获取更高的经济效益。
1 仪器与试剂
1.1 仪器BS400S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，电子恒温鼓风干燥箱 (上海跃进医疗器械厂)，P200Ⅱ型高压液相色谱仪(大连依立特分析仪器有限公司)，UV200Ⅱ紫外可变波长检测仪(大连依利分析仪器有限公司)。
1.2 试剂甲醇(AR) ，氯仿(AR)， 甲酸(AR)， 浓盐酸(AR)，氢氧化钠(AR)，浓硫酸(AR)，95%乙醇(AR)，磷酸氢二钠(AR)，磷酸(AR)，硅胶(柱层层析用，青岛海洋化工厂分厂) ，强碱性阴离子交换树脂201×4(山东鲁抗医药股份有限公司)，弱碱性阴离子交换树脂330(山东鲁抗医药股份有限公司)，弱碱性大孔吸附树脂D941(山东鲁抗医药股份有限公司)，八角干果(2008年由广西金绣香精香料股份公司提供)，莽草酸标准样品(上海中药标准化研究中心提供)。
2 方法
2.1 提取的工艺流程提取的工艺流程见图2。图2 八角茴香油的提取工艺流程
2.2 样品处理
2.2.1 八角茴香油的提取称取50 g的八角，按一定料液质量比将蒸馏水加入圆底烧瓶中，用挥发油提取装置进行提取八角茴香油3次，加热温度为100℃，收集其挥发油。第1次按1∶8料液质量比循环浸提3 h;第2次和第3次分别按1∶7和1∶6料液质量比循环浸提2 h。提油结束后读出提油装置中茴香油的体积，计算出得油率。
2.2.2 阴离子交换树脂的预处理[11]预处理流程为：乙醇浸泡 →水洗→酸洗→碱洗。
2.3 莽草酸样品的制备
2.3.1 阴离子交换树脂分离纯化莽草酸将经过预处理的150 g树脂和水同时倒入层柱析中，然后将八角水提液缓慢加入柱中，待交换完全后，用1.5～2.0倍树脂体积的2%的稀硫酸洗脱。每50 ml收集一次洗脱液，然后用旋转蒸发仪浓缩，加入少量乙醇溶解，用薄层色谱点板定性检测是否有莽草酸。如确定有莽草酸的存在，然后在室温下进行重结晶，使莽草酸晶体析出。
2.3.2 硅胶吸附的方法分离纯化莽草酸将水溶液浓缩旋干后，加入少量的乙醇，使其能重新充分溶解，加入80 g的硅胶(已在110℃烘干活化2 h)搅拌均匀，再倒入圆底烧瓶中用旋转蒸发仪旋干，然后倒入研钵中研碎，再放入烘箱中烘干，冷却后贮于干燥器中待用。使用干法装柱，然后用洗脱剂进行洗脱，再用旋转蒸发仪浓缩，加入少量乙醇溶解，用薄层色谱点板定性检测是否有莽草酸。如确定有莽草酸的存在，然后在室温下进行重结晶，使莽草酸晶体析出。
2.4 阴离子交换树脂的再生[12]用3%～5%的盐酸溶液浸泡2～4 h，用蒸馏水洗至中性，再用3%～5%的氢氧化钠溶液浸泡2～4 h，用蒸馏水洗至中性，备用。
2.5 莽草酸的薄层色谱法定性检测使用薄层色谱法检测的展开剂[13]：氯仿∶甲醇∶甲酸体积比=7.5∶0.5∶0.5。
2.6 莽草酸的HPLC定量检测[14]
2.6.1 对照品溶液制备准确称取莽草酸标准样品0.005 g,用蒸馏水溶解，倒入5 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，配制成所含莽草酸的浓度为1.0 mg/ml的溶液。
2.6.2 HPLC色谱条件色谱柱：YWG C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm);流动相：V[0.01 mol/L Na2HPO4磷酸盐缓冲溶液]∶V[甲醇]=97∶3(磷酸盐缓冲溶液用磷酸调配，pH=3);流量：1.00 ml/min;检测波长：220 nm;进样量：10 μl;柱温：室温;灵敏度AUF：S=0.005。
2.6.3 标准曲线绘制精密吸取莽草酸标准样品溶液3，6，9，12 μl进样，测定色谱峰峰面积，并以色谱峰峰面积对标准样品的质量回归，得出回归方程。
2.6.4 精确度的测定精密吸取莽草酸标准样品溶液9 μl，按照上述色谱条件分别重复进样3次，测定精密度。
2.6.5 样品中莽草酸含量、得率、回收率的测定精确吸取用不同方法制备的莽草酸待测溶液10 μl进样，按照上述色谱条件测定待测溶液中莽草酸的色谱峰面积。计算样品中莽草酸的含量、得率和回收率。
3 结果
3.1 八角茴香油的得油率[15] X=0.990×3.3050.000×100%=6.543%在提取茴香油的过程中，精油在一直不断地蒸馏出来，水分有所损失。采取多次提取与蒸馏的次数，可以提高八角茴香油的得油率。
3.2 莽草酸定性检测结果在硅胶薄层上，制备的莽草酸样品与莽草酸标准样品在同一位置上出现相同颜色的斑点，Rf值为0.56。
3.2.1 莽草酸标准样品的标准曲线以莽草酸标准样品的色谱峰峰面积对莽草酸标准样品的含量回归，得回归方程Y=53 239X-22 614，r=0.997 2。其线性范围在0～12.0 μg内，具有良好的线性关系。见图3。
3.2.2 精密度的测定结果结果见表1。精密吸取莽草酸标准样品溶液9 μl，按照相同的色谱条件分别重复进样3次，测得其标准偏差为1.702×104，精密度为3.68%，精密度良好。图3 莽草酸标准样品的标准曲线表1 精密度实验结果
3.2.3 样品中莽草酸的高效液相色谱图在柱温为20℃和柱温为30℃条件下，进样10 μl莽草酸标准样品，分别得到20℃和柱温为30℃条件下的莽草酸标准样品的高效液相色谱图见图4～5，在色谱条件下莽草酸标准样品的保留时间分别为4.36，3.75 min，峰形较好，在相应条件下通过将莽草酸样品的峰面积与莽草酸标准样品的峰面积对比，即可算出在相同的色谱条件下莽草酸样品中莽草酸的含量。图4 柱温为20℃标准样品的高效液相色谱图 图5 柱温为30℃标准样品的高效液相色谱图
图6为用硅胶吸附分离纯化的莽草酸样品的高效液相色谱图，进样量为10 μl，柱温为20℃。在色谱条件下2号峰的保留时间为4.30 min，与10 μl莽草酸标准样品的保留时间4.36 min大致相同， 可认为2号峰为莽草酸样品峰，该样品中含有莽草酸。
图7为用201×4强碱性阴离子交换树脂吸附分离纯化的莽草酸样品的高效液相色谱图，进样量为10 μl，柱温为30℃。在色谱条件下1号峰的保留时间为3.69 min，与10 μl莽草酸标准样品的保留时间3.95 min大致相同，可认为1号峰为莽草酸样品峰，该样品中含有莽草酸。 图6 用硅胶纯化、柱温为20℃的莽草酸样品的高效液相色谱图 图7 用201×4树脂纯化、柱温为30℃的莽草酸样品的高效液相色谱图 图8为用D941弱碱性大孔吸附树脂分离纯化的莽草酸样品的高效液相色谱图，进样量为10 μl，柱温为20℃。在色谱条件下3号峰的保留时间为4.09 min，与莽草酸标准样品的保留时间4.36 min基本相同，可认为3号峰为莽草酸样品峰，该样品中含有莽草酸。图8 用D941树脂纯化、柱温为20℃的莽草酸样品的高效液相色谱图 图9为用330弱碱性阴离子交换树脂分离纯化的莽草酸样品的高效液相色谱图，进样量为10 μl，柱温为20℃。在色谱条件下3号峰的保留时间为4.22 min，与莽草酸标准样品的保留时间4.36 min基本相同，可认为3号峰为莽草酸样品峰，该样品中含有莽草酸，但样品中所含杂质较多。图9 用330树脂纯化、柱温为20℃的莽草酸样品的高效液相色谱图
3.3 样品中莽草酸含量、得率及回收率的测定结果按“2.6.5”项中的公式计算得出以下测定结果。结果见表2～3。表2 样品中莽草酸含量测定结果表3 样品中莽草酸得率及回收率测试结果
经高效液相色谱仪测定，50 g八角水提液中的莽草酸质量为2 205.47 mg,含量为4.41%。与一些文献中的报道有一定差距，主要是由于购买的八角的产地与报道的文献的不同。由表2～3数据可知，除330树脂外，用碱性阴离子交换树脂吸附提取出来的莽草酸的含量和回收率比硅胶吸附提取出来的要高一些，但色素的脱除效果不太明显。
4 讨论
在提取茴香油的过程中，精油在一直不断地蒸馏出来，而水分会有所损失。采取多次提取与蒸馏，可以提高八角茴香油的得油率，有利于提高莽草酸的浸出率。
硅胶与碱性阴离子交换树脂吸附分离纯化莽草酸相比，除330树脂外，硅胶吸附提取分离出的产物其莽草酸含量比碱性阴离子交换树脂提取出来的要低，但脱除色素的效果较好。虽然碱性阴离子交换树脂提取出来的产物莽草酸的含量较高，但色素不易脱除，影响莽草酸结晶的颜色。
用强碱性阴离子交换树脂201×4吸附分离纯化的莽草酸的含量达到 91.59%，得率为2.76%，回收率为57.22%，但脱除色素效果较差;用弱碱性大孔吸附树脂D941吸附提取的莽草酸含量为28.02%，得率为0.23%，回收率为1.49%，脱除色素的效果较好。而用硅胶吸附提取的莽草酸的含量为13.36%，得率为0.22%，回收率为0.66%，脱除色素效果最好。
通过实验表明，用强碱性阴离子交换树脂201×4吸附分离纯化莽草酸的效果最好，因此，选用强碱性阴离子交换树脂更适合莽草酸的分离纯化，但如何能更好地脱除色素还有待进一步深入研究。
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