文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究抗菌药物敏感性试验中不同实验方法的灵敏度与助溶剂的选择、助溶剂添加限量。方法在同一条件下使用头孢拉定为实验对象横向对比了纸片扩散法、琼脂二倍稀释法、琼脂二倍稀释法与菌落计数相结合法的灵敏度，以及二甲基亚砜、丙酮、乙醇对细菌的生物毒性影响，并使用头孢拉定的抗菌敏感性实验对选择出的实验方法及助溶剂进行了复核。结果琼脂二倍稀释与菌落计数相结合的方法可基本排除药液颜色对实验结果的影响而且灵敏度较高;助溶剂二甲基亚砜性质稳定且对细菌的抑制作用较弱。结论在多种实验方法中，琼脂二倍稀释与菌落计数相结合的方法可给出较其他方法更为精确的MIC结果;使用浓度低于5%的二甲基亚砜作为助溶剂是安全可靠的。
       【关键词】  抗菌; 药物敏感性; 实验方法; 助溶剂
       抗菌药物敏感性试验是一种用于考察药物抗菌活性的体外实验，一般被用于抗菌药物的初期筛选及对抗菌药物的临床疗效进行预测[1]。由于抗菌药物敏感性试验的实验结果将直接影响到临床使用抗菌药物的初期筛选，因此保证抗菌药物敏感性试验的准确合理十分重要。
       然而在实际操作中，抗菌药物敏感性试验有多种不同的方法，而目前尚无文献对抗菌药物敏感性试验中不同实验方法的灵敏度进行选择比较;再加上很多药品尤其是中药具有难溶于水的特点，也没有文献对抗菌药物敏感性试验中助溶剂的选择及添加限量进行报道。这都为抗菌药物敏感性试验的操作及分析工作带来了许多不确定因素。
       鉴于不同的抗菌药物敏感性试验方法灵敏度有较大差异。而有机助溶剂不但自身具有毒性，还可能与待测药品产生协同、相加等毒性效应。本文在同一条件下使用注射用头孢拉定为实验对象，横向对比了3种常用抗菌药物敏感性试验方法：纸片扩散法，琼脂二倍稀释法，琼脂二倍稀释与菌落计数相结合法的灵敏度;并考察了3种常用有机助溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、乙醇对细菌的生物毒性影响;并使用头孢拉定的抗菌敏感性实验对选择出的实验方法及助溶剂进行了复核，力图为抗菌药物的敏感性评价提供较为准确的依据和参考。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器HH-B11-420电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);LS-B50L型立式圆形压力蒸气灭菌器(上海医用核子仪器厂);超净工作台(苏州净化设备厂);AL204精密电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);微量加样器(SOCOREX.Swiss公司)。
       1.2 试剂及试药 营养琼脂培养基(北京三药科技开发公司);营养肉汤培养基(北京三药科技开发公司);注射用头孢拉定(齐鲁制药有限公司);二甲基亚砜(天津市标准科技有限公司生产);丙酮(天津市北方天医化学试剂厂);无水乙醇(天津市北方天医化学试剂厂);试剂均为分析纯。
       2 方法
       2.1 不同抗菌药物敏感性试验方法灵敏度的考察
       2.1.1 不同浓度头孢拉定药液的制备取无菌试管12只。取100 mg头孢拉定放入第1支试管，加入无菌蒸馏水10 ml，于2～11只管中加无菌蒸馏水5 ml。从第1支试管中取出5 ml药液加入第2支试管，将第2管混合后取出5 ml，加入第3管，再混合后取5 ml放入第4管，如此连续稀释至第11管取出5 ml弃去。这样1～11管含有不同浓度药液各5 ml。第12管支加入5 ml无菌蒸馏水作为对照。平行制备两份。
       2.1.2 营养琼脂培养基的制备称取所需量的营养琼脂培养基，按照每32 g营养琼脂培养基加入1 L水的比例加入蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，置于48～50 ℃水浴中备用。
       2.1.3 纸片扩散法实验方法 按照临床微生物学手册提供的操作方法[2]进行纸片扩散法培养基的制备及纸片的制备。
       将按照方法“2.1.1”制备的不同浓度头孢拉定药液分别吸取1 ml稀释至20 ml无菌蒸馏水中，使药液浓度分别为0.5，0.5×2-1，0.5×2-2，……，0.5×2-10 mg/ml。按照临床微生物学手册提供的操作方法进行细菌接种。
       2.1.4 琼脂二倍稀释法实验方法将按方法“2.1.2”制备的营养琼脂培养基分装至试管中，每支试管中19 ml。
       将按方法“2.1.1”制备的不同浓度头孢拉定药液分别吸取1 ml加入营养琼脂培养基中。制备成为含药液浓度分别为0.5，0.5×2-1，0.5×2-2，……，0.5×2-10 mg/ml的营养琼脂培养基，置于48～50 ℃水浴中备用。按文献方法进行细菌接种[3]。
       2.1.5 琼脂二倍稀释与菌落计数相结合法按照方法“2.1.4”制备所需浓度的含药琼脂。
       按菌落计数法，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌至营养肉汤培养基中，培养18～24 h。用0.9%无菌氯化钠溶液配制成每毫升含菌数为50～100 cfu的悬浊液。将制备好的菌液取1 ml加入按照方法“2.1.4”制备的含药营养琼脂培养基中，混合均匀后注入φ90 mm平皿中[4]。待凝固后放入培养箱中培养。
       2.1.6 结果观察于35 ℃培养箱中培养24 h。观察不同抗菌药物敏感性试验方法中头孢拉定药液对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌的抑制效果。
       2.2 抗菌药物敏感性试验助溶剂的选择
       2.2.1 不同浓度有机溶剂的制备取无菌试管6只，于第1管加入8 ml有机溶剂，2～6只管中加入无菌蒸馏水4 ml。将第1管取出4 ml加入第2管，混合后取出4 ml，加人第3管，再混合后取4 ml放人第4管，如此连续稀释至第5管取出4 ml弃去，第6管以无菌蒸馏水作空白对照。平行制备两份。
       2.2.2 含有机溶剂营养琼脂培养基的制备将按方法“2.1.2”制备的营养琼脂培养基分装至试管中，每支试管中16 ml。
       将按方法2.2.1制备的不同浓度的有机溶剂分别加入装有营养琼脂培养基的试管中，制成含有机溶剂浓度分别为20%，10%，5%，2.5%，1.25%，0%的营养琼脂培养基。
       2.2.3 细菌接种按方法“2.1.5”中菌落计数法接种细菌。
       2.2.4 结果观察于35 ℃培养箱中培养24 h，进行菌落计数。观察不同浓度有机溶剂对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌的抑制效果。
       2.3 二甲基亚砜对头孢拉定药物敏感性试验的影响
       2.3.1 所需药液的制备按方法“2.1.1”制备头孢拉定药液。
       另取12支试管，用5%的DMSO代替蒸馏水，按“2.1.1”方法制备药液。平行制备两份。
       2.3.2 含药营养琼脂培养基的制备及细菌的接种按方法“2.1.5”进行实验。
       2.3.3 结果观察于35℃培养24 h，进行菌落计数。对比观察有无二甲基亚砜助溶剂对头孢拉定药物敏感性试验的影响。
       3 结果
       3.1 不同抗菌药物敏感性试验方法的选择结果表明，在头孢拉定药物敏感性试验中，纸片扩散法、琼脂二倍稀释法、琼脂二倍稀释与菌落计数相结合法3种方法的实验结果有较大差别。
       在3种实验方法中，琼脂二倍稀释与菌落计数相结合法对头孢拉定药物敏感性试验的灵敏度最高，其次为琼脂二倍稀释法，纸片法灵敏度最低。
       3种实验方法对金黄色葡萄球菌及对大肠埃希氏菌灵敏度结果相同。结果见表1。表1 头孢拉定药物敏感性试验中纸片扩散法、琼脂二倍稀释法、琼脂二倍稀释法与菌落计数相结合法3种方法实验结果
       3.2 抗菌药物敏感性试验助溶剂的选择 结果表明，乙醇、丙酮、二甲基亚砜3种助溶剂对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌的生长均有一定影响。
       对金黄色葡萄球菌的抑制效果由强到弱依次为：乙醇>丙酮=二甲基亚砜。相比之下，助溶剂对大肠埃希氏菌的抑制效果较对金黄色葡萄球菌的抑制效果更为明显，依次为：乙醇>丙酮>二甲基亚砜。其影响程度均随助溶剂浓度的降低而减小。结果见表2。表2 乙醇、丙酮、二甲基亚砜对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌生长的影响
       3.3 二甲基亚砜对头孢拉定药物敏感性试验的影响结果表明，在加入5%的二甲基亚砜助溶剂的情况下，所测头孢拉定对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌的MIC均与不加入二甲基亚砜组所测数值一致。结果见表3。证明浓度不超过5%的二甲基亚砜是一种稳定可靠的助溶剂。
       4 讨论
       自然界中存在多种细菌类型，大体可分为革兰氏染色阴性菌和革兰氏染色阳性菌两大类。本实验选择了革兰氏染色阴性菌的代表菌种大肠埃希菌和革兰氏染色阳性菌的代表菌种金黄色葡萄球菌作为实验对象，有较大的代表性。
       常见的抗菌药物敏感性试验还有比浊法，但因比浊法不适用于带有颜色的药液，有一定的局限性，因此本实验没有将比浊法列入考查范围。除比浊法外的几种方法中，琼脂二倍稀释与菌落计数相结合的方法灵敏度较高，且基本可以排除药液颜色对试验结果的影响，提供较为准确的结果，适用于需精确测定药物最低抑菌浓度的实验。因此实验采用琼脂二倍稀释与菌落计数结合法作为考察抗菌药物敏感性试验最佳助溶剂的实验方法。表3 有无二甲基亚砜助溶剂在头孢拉定药物敏感性试验中的影响
       比较乙醇、二甲基亚砜、丙酮三种常用助溶剂的理化性质，3种助溶剂的沸点分别为78.3，189 ，56.12 ℃。综合实验结果，二甲基亚砜自身性质相对较稳定，能与多种有机试剂相混溶，并且对金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌的影响相对较小，是一种较为理想的助溶剂。
       本实验以头孢拉定作为实验化合物，对比有无二甲基亚砜助溶剂两种情况下对药物敏感性试验的影响。所得两组实验结果吻合度较好，可证明在抗菌药物敏感性试验中，使用浓度低于5%的二甲基亚砜作为助溶剂是安全可靠的。
       【参考文献】
         　[1] 黄菊招，孟小斌.抗菌药物体外敏感性实验在应用中存在的问题及解决方法初探[J]. 广东药学， 2004， 14(1): 53.
       
       [2] 默里.临床微生物学手册[M].北京：科学出版社，2006 : 2154.
       
       [3] 李仲兴，王秀华，赵建宏，等.五倍子等5种中药对112株表皮葡萄球菌抗菌作用的比较研究[J].中国中医药科技，2008， 15(1): 38.
       
       [4] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社，2005:附录XIII.