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       【摘要】 
       目的研究斑蝥酸钠对体外培养的人食管癌Eca109细胞中Bcl-2、p53基因表达的影响。方法采用流式细胞仪检测、分析斑蝥酸钠处理前后人食管癌Eca109细胞中Bcl-2、p53基因表达的变化。结果不同剂量斑蝥酸钠作用24h均可使Bcl-2、p53基因在人食管癌Eca109细胞中的表达下降(p<0.01)。结论斑蝥酸钠可抑制Bcl-2、p53基因在人食管癌Eca109细胞中的表达。
       【关键词】  斑蝥酸钠; Bcl-2; p53; 人食管癌Eca109细胞株
       斑蝥酸钠(Sodium cantharidinate,SCA)系斑蝥素的半合成衍生物，毒性、刺激性较斑蝥素轻，抗肿瘤作用明显优于斑蝥素[1]，且抗癌谱较广，临床单药或联合化疗对肝癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤均有一定疗效 [2]，是一种广谱抗癌新药，但对斑蝥酸钠抗食管癌的基础研究较少。本实验已对其抑制人食管癌Eca109细胞生长,诱导细胞凋亡的作用进行了研究,为进一步探讨其诱导凋亡和抗肿瘤的机制，采用流式细胞仪检测斑蝥酸钠作用前后Bcl-2、p53基因在人食管癌Eca109细胞中的表达变化，观察斑蝥酸钠对Bcl-2、p53基因表达的影响,为其临床应用提供理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 试剂RPMI1640培养液：美国GIBCO;新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司;胰酶：南京生兴生物技术有限公司;斑蝥酸钠注射液:贵州神奇集团，批号20041113;顺铂(冻干型):齐鲁制药有限公司，批号04050111;Bcl-2，P53荧光标记单抗:美国BD公司，批号：556570。
       1.2 细胞系人食管癌Eca109细胞株:购于上海细胞所。将细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，长满后用0.25%胰酶消化传代。
       1.3 仪器CO2细胞培养箱:NAPCO，USA;FACSCaliuber型流式细胞仪:BD，USA。
       2 方法
       2.1 药液的制备及分组情况将斑蝥酸钠注射液用适量的无血清RPMI1640培养液分别配成3种浓度，大、中、小终浓度分别为5 000，2 500，1 000 μg·L-1，顺铂作为阳性对照其剂量按临床用量换算，终浓度为25 000 μg·L-1。实验共设用药组大、中、小3个浓度、阳性对照组和细胞对照组。
       2.2 流式细胞仪检测取处于指数生长期的人食管癌Eca109细胞，加药培养24 h后，用适量0.02%EDTA进行消化，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心，PBS洗涤2次，配成1×109·L-1细胞悬液，75%冷乙醇-20℃固定，上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次，用0.5mlPBS悬浮细胞,制成细胞悬液，分别加入Bcl-2，P53荧光标记单抗，4℃避光染色30 min以上;用PBS洗细胞一次，弃上清，加PBS0.5 ml悬浮细胞，上机检测。
       2.3 统计学处理本实验采用χ2检验分析。所有统计均用SPSS11.0统计软件包上进行。
       3 结果
       3.1 Bcl-2表达的变化如表1所示，与细胞对照组相比，不同剂量的斑蝥酸钠均可使人食管癌Eca109细胞中Bcl-2表达率降低，且随着剂量增大，作用更明显。表1 斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞中Bcl-2表达的影响
       3.2 突变型P53表达的变化如表2所示，与细胞对照组相比，不同剂量的斑蝥酸钠可使突变型P53的表达率降低，且随着剂量增大，作用更明显。表2 斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞中P53表达的影响
       4 讨论
       细胞凋亡与细胞增殖失衡在食管癌的发生发展中起重要作用。细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程,涉及一系列基因表达的级联反应,受凋亡抑制基因和凋亡促进基因的调控。Bcl-2、P53是重要的细胞凋亡调控基因。Bcl-2基因是目前研究最多的一种凋亡拮抗基因，在多种肿瘤组织中，由于它异常的高表达，可使肿瘤细胞群逃避和减少凋亡，造成增殖细胞群的细胞数量增多，这与肿瘤的恶性生物学行为和预后不良有密切关系[3]。P53是一种抑癌基因，根据其基因蛋白功能的不同可分为野生型和突变型两种，流式细胞仪检测到的通常是突变型P53，因为野生型P53的半衰期极短，而当P53基因发生突变后，蛋白质构型发生改变，半衰期延长，此时较易检出。突变型P53基因相当于一个癌基因，可引起细胞增殖加快和凋亡受阻，导致肿瘤的发生。
       近年来，诱导细胞凋亡被视为抗癌药物研究和开发的新靶点[4]。在前期实验研究中，我们发现，斑蝥酸钠对人食管癌Eca109细胞生长有抑制作用，可诱导食管癌细胞凋亡[5]。本实验结果显示，与细胞对照组相比,经斑蝥酸钠处理后的人食管癌Eca109细胞中Bcl-2和突变型P53的表达均明显下降，且呈剂量依赖关系，表明该药可减弱Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用 ，其诱导细胞凋亡与抑制Bcl-2表达有关。突变型P53在肿瘤细胞中表达下降，可能是斑蝥酸钠抗食管癌的机制之一。图1 人食管癌细胞Eca109中Bcl-2表达流式细胞仪分析图　图2 人食管癌细胞P53表达流式细胞仪分析图
       【参考文献】
         　[1] 高 倬，姜 平，熊惠周，等.斑蝥素衍生物与铂络合物抗癌活性的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志，1999,19(1):37.
       
       [2] 孙伟芬，黄伟贤，王惠杰，等. 斑蝥酸钠注射液治疗晚期癌症的临床观察[J]. 中国医院药学杂志，2001，21(7):428.
       
       [3] 李 洁. 半枝莲对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞bcl-2基因表达的影响[J]. 中药药理与临床，2007，23(1)：46.
       
       [4] 张玉军，刘淑霞，齐凤英，等. 戊地昔布诱导人食管癌细胞凋亡的机制研究[J]. 中国药理学通报，2006，22(6)：629.
       
       [5] 梁 枫，王明艳，许冬青.斑蝥酸钠诱导人食管癌Eca109细胞凋亡实验研究[J]. 中国中医药信息杂志，2007，14(3):22.