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       【摘要】 
       目的在微波条件下寻找提取百合总黄酮的优化条件。方法对百合中黄酮类化合物的微波提取及其抗氧化性进行研究。提取采用正交实验法，抗氧化性研究采用培养箱储藏法。结果百合总黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数80%，提取时间4 min，固液比1 g∶20 ml，微波功率620 W，提取率可达6.78%。结论微波法提取百合总黄酮含量较高;抗氧化性结果显示，提取物的加入量对猪油的自氧化有量效关系。提取的黄酮类化合物对猪油的氧化有明显的抑制作用，且随加入量的增多，抗氧化能力增强。
       【关键词】  微波提取; 总黄酮; 百合; 正交实验; 抗氧化性
       百合L.brownij var. viridulum Baker为百合科百合属植物，是多年生的鳞茎草本花卉植物。百合以鳞茎供食用，味甘性平，无毒。百合鳞茎含蛋白质、脂肪及多种生物碱，并富含淀粉及少量钙、磷、铁等。其具有益气安神、润肺止咳之功效，适用于治疗体虚肺弱、失眠、心悸、精神不宁等症[1]。
       黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的酚性组分，目前已知的黄酮类化合物单体己达八千多种，黄酮类化合物可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、二氢黄酮等。微波提取技术是利用微波能来提高提取率的一种新技术，与常规方法相比，微波提取具有选择性高、快速高效、溶剂消耗小、活性成分得率高、不产生噪音、适合热不稳定物质等特点[2，3]。近年来研究发现黄酮类化合物有抗突变、抗肿瘤、抗炎、抗菌、降血脂、镇痛、治疗心血管疾病等广泛生物学活性，其中最为重要的是它能减少自由基形成和清除自由基的抗氧化活性，对含脂食品的自动氧化防止有一定的作用，是一类值得深入研究的天然产物[4～6]。本实验通过对百合微波提取总黄酮及抗氧化性研究，为提供百合的药物及抗氧化作用研究提供理论基础。
       1 材料与仪器
       百合购自泉州医药百合连锁公司涂门店，产地甘肃兰州。于57℃下烘干，研碎后过60目筛备用。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，纯度98%)。美的微波炉(广州美的电器有限公司);UV-1100型紫外可见分光光度计(上海诺顶仪器设备有限公司);MP200B电子天平(上海精密仪器仪表有限公司);离心机(LC10-24A，北京医用离心机厂)。化学试剂均为分析纯，北京化工厂生产。
       2 方法
       2.1 百合总黄酮含量的测定方法
       2.1.1 标准曲线的制作精确称取120℃干燥恒重的芦丁510 mg， 用60%微热乙醇定容至50 ml，摇匀， 得浓度为0.1 mg·ml- 1的标准液[7]。准确吸取标准液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml于6支具塞试管中，加30%乙醇，使各试管溶液为5 ml，各加5%NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，放置6min，加10%Al(NO3)3溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加1 mol·L-1NaOH溶液4 ml，蒸馏水0.4 ml，摇匀，放置10至15 min，用85%的乙醇作空白对照，于510 nm 波长下测定吸光度，以吸光度值对芦丁对照品含量绘制标准曲线，回归方程A=1.104 9C+1.6×10-3，其线性范围为0～0.5 mg，相关系数r= 0.999 8。
       2.1.2 百合总黄酮的微波提取准确称取百合粉末2.00 g置烧杯中，根据试验设计分别选用不同超声波频率、固液比、处理时间、乙醇浓度进行总黄酮提取。在用微波处理前，每个样品瓶所配5瓶空白瓶，均需凉至室温，以减少试验误差[7～9]。准确吸取4 ml经微波提取的粗提液于装有200 mg聚酰胺粉的小烧杯中，搅匀，然后转移至装有400 mg聚酰胺粉的砂芯层析柱中(已用70%乙醇预处理)，吸附10 min，用乙醇的不同浓度梯度逐级洗脱， 以70%，80%，90%，100%的乙醇各10 ml依次洗涤，收集各级洗涤液，用85%的乙醇定容至50 ml，备测。
       2.1.3 百合总黄酮含量测定精确吸取5 ml样液3份于3支具塞试管中，各加5%NaNO2 溶液0.3 ml，摇匀， 放置6 min，各加10%Al(NO3)3溶液0.3 ml，摇匀，放置6min，各加1 mol·L-1NaOH溶液4 ml，蒸馏水0.4 ml，摇匀，放置10至15 min，用85%的乙醇作空白对照， 于510 nm 波长下测定吸光度A。总黄酮得率按下式计算：
       得率(%)=(C×V1×V3)/(W×V2×V4)×100%式中，C为根据回归方程计算得到的总黄酮量(mg);V1为抽提定容的体积(ml);V2聚酰胺处理时取样的体积(ml);V3聚酰胺处理后定容的体积(ml);V4显色反应测定取用样液体积(ml);W为称样量(g)
       2.1.4 微波萃取百合总黄酮工艺条件的正交优选试验[8～11]选择影响百合总黄酮含量的主要因素：乙醇浓度、固液比、微波功率、提取时间。确定不同的水平，以乙醇为提取溶媒， 以百合总黄酮得率为考察指标，采用L16(44)正交实验方案，实验因素水平设计方案见表1。
       2.2 黄酮类化合物的抗氧化活性研究(碘-硫代硫酸钠滴法:GB/T5009.37-1996)[12～18] 用80%的乙醇配置浓度为0.01%，0.02%，0.03%的提取物溶液， 将纯猪油及0.01% ，0.02% ，0.03%提取物溶液的猪油置于50℃恒温箱中，每隔3 d测定其过氧化值(POV值) 。POV值= ( v2 - v1 ) ×C ×0. 126 9 ×100/mv2 :样品消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mlv1 : 空白试剂消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mlC : 硫代硫酸钠标准溶液的浓度，moL /Lm : 样品质量， g
       滴定步骤:称取3.00 g混匀的样品，置于250 ml碘瓶中，加30 ml三氯甲烷- 冰乙酸混合液，使样品完全溶解。加入1.00 ml饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5 min，然后在暗处放置3 min。取出时加水100 ml水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液(0.002 mol/L)滴定，至淡黄色时，加1 ml淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点。以同样方法，做空白试剂实验。表1 因素水平
       3 结果
       3.1 百合总黄酮含量的结果
       3.1.1 微波提取百合总黄酮正交实验结果及极差分析见表2。表2 优化提取条件正交实验结果与分析
       由表2的极差R分析可知：4因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为D>A>B>C，即微波处理时间>乙醇浓度>固液比>微波功率。确定最佳工艺条件为A3B3C4D4，即乙醇浓度80%，微波功率620 W，处理时间4 min， 固液比1∶20。通过验证试验，测得总黄酮含量为6.78%。
       3.1.2 试验的方差分析 对试验数据进行方差分析， 提取时间对百合总黄酮得率的影响显著， 其余诸因素均为非显著。方差分析结果见表3。
       3.1.3 微波提取与其他提取方法的比较选取同条件进行微波、超声循环提取、索氏提取比较。结果见表4。由表4可见，与超声循环提取法以及索氏提取法相比， 微波提取技术大大缩短了提取时间， 而且提取率有所增加。因此， 微波提取法节能、省时、高效，适合应用于工业化生产。表3 方差分析　表4 微波提取与其他提取方法的比较
       3.2 抗氧化活性结果分析影响黄酮类化合物抗氧化活性的因素，最主要的是羟基化的程度和羟基位置。一般来说，B环中的邻二羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用。黄酮类于O2 -·、-OH的反应相当于一个连锁反应在终结阶段的反应，在消除O2-·、-OH的反应中起着氢供体的作用，使具有高度氧化活性的自由基还原，从而达到消除的目的[14～19]。
       将纯猪油及添加0.01%，0.02%，0.03%，0.04%的乙醇提取液的猪油置于50℃恒温箱中，每隔3 d测定计算其POV值，结果如表5所示。百合的乙醇提取液具有抗氧化性能，并且随提取液浓度升高，过氧化值变小，抗氧化性增强。表5 百合黄酮化合物对猪油的抗氧化作用mmol·kg-1
       抗氧化性比较:为了进行相关比较，分别在猪油中加入0.3%的百合乙醇提取液、抗坏血酸、柠檬酸。每隔几天计算其POV值。结果如表6所示。3种试剂中抗氧化性活性顺序为:提取液>抗坏血酸>柠檬酸。百合提取液的抗氧化性比较强。表6 不同抗氧剂对猪油的抗氧化作用mmol·kg-1
       4 讨论
       从表4可看出，同等条件下，百合微波提取总黄酮的效率优于超声循环和索氏提取法。即微波提取技术具有省时、高效、节能等优点，在百合总黄酮提取中是最佳的提取方法。值得推广应用。微波提取百合总黄酮最主要影响因素为提取时间，其次是乙醇浓度、固液比、微波功率。提取百合总黄酮提取的最佳工艺条件为A3B3C4D4， 即乙醇浓度80%，微波功率620 W， 处理时间4 min， 固液比1∶20，总黄酮含量为6.78%。
       目前，从银杏叶、桑叶等提取总黄酮制成片剂、针剂已在临床上应用较为广泛并取得较好疗效。银杏叶总黄酮含量约2.5%～5%(干重)[20,21]，桑叶总黄酮含量为1%～3%(干重)[22]。而微波提取的百合总黄酮含量(6.78%)揭示百合是总黄酮含量较高的药物资源。
       百合黄酮类化合物的抗氧化性较强，且具有剂量效应关系，即在本实验剂量范围内百合总黄酮加入量越大，其抗氧化效果越好。通过对猪油的抗氧化效果试验发现：其抗氧化效果比抗坏血酸和柠檬酸稍强。
       百合资源丰富， 微波提取百合总黄酮安全性高，提取工艺简单，且总黄酮含量较高。因此，可进一步对百合总黄酮进行药理研究，有望成为提取医用黄酮和抗氧化剂的新原料。
       【参考文献】
         　[1] 陈永元.百合小常识[J].农村实用工程技术，2003，10:27.
       
       [2] 孙智敏，李发堂，殷 蓉，等.黄酮类化合物提取工艺研究进展[J].河北化工.2005，4:7，30.
       
       [3] Yue M E， Jiang T F， Shi Y P.Fast determ ination of flavono ids in H ipp op hae rham noid es and its medicinal prep aration by cap illary zone electropho resis using dimethyl-β-cyclodextrin as modifier [J ] . T alanta， 2004， 62：695.
       
       [4] 陈 琪， 王伯初， 唐春红，等.黄酮类化合物抗氧化性与其构效的关系[J]. 重庆大学学报(自然科学版)，2003，26:111.
       
       [5] Y. Hanasaki， S. Ogawa， S. Fukui. The correlation between active oxygen scavenging and antioxidative effects of flavonoids[J].Free Radic BiolMed ，1999，16：845.
       
       [6] J. - B. Galey. Potential use of iron chelators against oxidative damage[J].Adv. Pharmacol，1997，38：167.
       
       [7] 蔡建秀，黄艳艳，许婉珍.乌蕨黄酮类化合物薄层成分分析[J].海峡药学，2006，18(1):99.
       
       [8] 苏东林，单 杨，李高阳.微波法提取柑桔皮总黄酮的应用研究[J].食品与机械，2007，23(3)：73.
       
       [9] 李姣娟，黄克瀛，龚建良，等.微波法提取川桂叶总黄酮工艺条件的研究[J].食品研究与开发，2007，28(8):71.
       
       [10] 蒋益花，陈敏明，吴美媛.微波法提取木芙蓉花总黄酮的工艺研究[J].中国酿造，2007，2:34.
       
       [11] 杨喜花， 陈 敏，张 华，等.微波法提取沙棘叶总黄酮的工艺研究[J].中草药，2006，37(4):535.
       
       [12] 王肇慈. 粮油食品品质分析，第2版[M]. 北京: 中国轻工业出版社， 2000：257.
       
       [13] 王 芳，励建荣，蒋跃明.桑叶黄酮的提取纯化及对油脂抗氧化活性的研究[J].中国粮油学报，2006，21(4):106.
       
       [14] 宋常春，鲍庆胜.柿叶黄酮类化合物提取方法和抗氧化性的研究[J].食品与发酵工业，2004，30(9):117.
       
       [15] 孙崇鲁，黄克瀛，陈丛瑾，等.香樟叶中黄酮类化合物提取方法和抗氧化性的研究[J].化学工程师，2006，7:4，66.
       
       [16] 吴春，胡小妹，陈林林，等.杜仲黄酮的提取及抗氧化活性研究[J]. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2004，20(5):509，11.
       
       [17] 李志洲.苦瓜中黄酮类化合物的提取及抗氧化性研究[J].中国生化药物杂志，2007，28(4):264.
       
       [18] 林燕如，丁利君.番石榴叶中黄酮类物质提取及其抗氧化性研究[J].现代食品科技，2007，23(10):58.
       
       [19] 万素英，赵亚军，李 琳，等.食品抗氧化剂[M]. 北京:中国轻工业出版社，1998：160.
       
       [20] 胡 春，丁霄霖. 黄酮类化合物在不同氧化体系中的抗氧化研究[J].食品与发酵工业，1996，3:46.
       
       [21] 柏桂英，柏小强，宋豫军，等. 银杏叶总黄酮的提取及保健饮料研究[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版)，2000，15:12.
       
       [22] 张传部.桑叶及其保健饮料中总黄酮含量测定的研究[J].食品科技，2000，2:53.