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       【摘要】 
       目的研究风轮菜乙醇提取物(EJCT)对血管内皮细胞的保护作用及机制。方法分别用过氧化氢 (H2O2 )和高糖建立体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型。MTT法检测细胞存活率;用试剂盒方法检测细胞超氧化物歧化酶 (SOD)和乳酸脱氢酶 (LDH)活力;用Griess 法测定上清液中NO2-浓度反映内皮细胞释放的一氧化氮 (NO)。结果不同浓度的EJCT能明显提高H2O2和高糖损伤的内皮细胞存活率，使H2O2 损伤的内皮细胞内低下的SOD活力回升，降低高糖诱导的内皮细胞LDH释放。另外，EJCT(3，10，30，100 mg/L)能增加HUVECs培养液中NO含量。结论风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞具有保护作用，机制可能与其抗氧化和促进NO的合成有关。
       【关键词】  风轮菜; 内皮细胞; 过氧化氢; 高糖; 一氧化氮
       血管内皮细胞介于血液与组织间，发挥着屏障作用，同时具有多种生理功能，对维持健康或病理环境下内环境的稳定起着积极作用。大量的研究表明，内皮功能异常已经成为2型糖尿病患者血管并发症的始发因素[1]。氧化应激是导致糖尿病患者血管内皮功能异常的重要因素[2,3]。因此，氧化应激在血管病变的发病中起关键作用，抗氧化治疗具有重要的临床意义。
       唇形科风轮菜属植物主要的化学成分为黄酮类、皂苷类、有机酸类、芳香族类、三萜类、甾体类等。目前的研究发现风轮菜属植物主要的药理作用为止血、抗菌、抗炎及免疫作用、抗辐射、抗肿瘤等[4]。风轮菜属植物风轮菜在福建民间用于治疗糖尿病，提示其可能具有保护血管内皮细胞损伤的作用。本实验室前期研究结果表明风轮菜乙醇提取物具有明显的降血糖作用[5]。为了探讨风轮菜是否具有保护血管内皮细胞的作用，本研究采用 H2O2 和高糖分别建立氧化应激损伤内皮细胞的模型, 观察不同浓度的风轮菜乙醇提取物对氧化应激损伤内皮细胞的保护作用, 并初步探讨其作用机制，为将其开发为糖尿病及其并发症治疗药物奠定基础。
       1 材料与仪器
       1.1 药材与试剂风轮菜全草采集于福建省莆田县萩芦镇，经中国药科大学中药资源学研究室秦民坚教授鉴定为Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze。风轮菜全草的80%乙醇提取物 (EJCT，中国药科大学中药药理教研室提供，得率18%);胎牛血清和M199培养基(Gibco公司);胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na，南京生兴生物技术有限公司);噻唑蓝 (MTT)和Endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue(ECGS，Sigma公司);三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，南京创瑞生物技术有限公司);磺胺 和N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司);硝普钠粉针(北京双鹤现代医药技术有限公司，批号20060609);乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20080331);超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070619)。其它试剂均为市售分析纯。
       1.2 仪器Multiskan spectrum MSS1500-320酶标仪，702型超低温冰箱和3111型细胞培养箱(Thermo Electron 公司);SW-CJ-IF超净台(苏州安泰空气技术有限公司);XSZ-D2倒置显微镜(重庆光学仪器厂);1-15K低温离心机(Sigma 公司)。
       2 方法
       2.1 原代人脐静脉内皮细胞的培养[6]采用胶原酶灌注消化法分离原代人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。无菌条件下，选取健康产妇脐带 (长度约20 cm)，除掉两端破损及水肿，4℃保存于磷酸缓冲液(PBS)中，4 h内进行分离。先用 PBS 溶液冲洗静脉腔内血液，然后置于37℃培养箱内，用0.1%Ⅱ型胶原酶消化15～20 min，收集消化液于1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集沉淀细胞。细胞重悬于M199培养液 (含10%胎牛血清;青霉素、链霉素各100 U/ml;ECGS 20 mg/L)中，移入预先铺好明胶的培养瓶内，于37℃、5%CO2 的培养箱中培养。24 h 后PBS冲洗、换新鲜培养基，2～3 d更换培养基，约接种后4～6 d，当细胞生长覆盖80%左右培养面时，0.25%胰酶消化，1∶2比例传代。内皮细胞Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞所特有，用免疫组织化学法检测到分离培养的人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原为阳性。
       2.2 EJCT对 H2O2 致 HUVECs 脂质过氧化损伤的保护
       2.2.1 MTT法检测内皮细胞存活率[7] 取对数生长期HUVECs消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板 (2×104cell/孔)内，37℃，5% CO2预培养24 h后，更换M199培养液，分为5组，每组3个平行。正常组为HUVECs的自然培养，模型组为HUVECs与500 μmol/L H2O2共培养，其余3组为EJCT (3，10，30 mg/L)与HUVECs及共培养，药物温育24 h之后，与H2O2共培养4 h，加入含0.5% MTT的培养基20 μl，再培养4 h后，弃培养液，加入150 μl的DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于490 nm波长处测定吸光值(A值)。实验重复3次，每次3个复孔。
       2.2.2 SOD活性的检测细胞传代培养后随机分为正常组、模型组及各浓度药物作用组，给药剂量及方法同“2.2.1”。实验结束时，弃细胞上清液，每孔加入50 μl细胞裂解液(20 ml含：40 μl 0.5 mol/L EDTA;4 ml 10% SDS;1 ml 1mol/L Tris-HCl;14.96 ml H2O，pH 6.8)，吹打细胞，然后取裂解液50 μl，试剂盒方法测定SOD活性。实验重复3次，每次3个复孔。
       2.3 EJCT对高糖致 HUVECs损伤的保护[8]
       2.3.1 MTT法检测内皮细胞存活率取对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(1×104 cell/well)，培养24 h后更换M199培养基，将细胞分为5组，正常组为HUVECs的自然培养，模型组为HUVECs与30 mmol/L葡萄糖共培养，其余组为EJCT(3，10，30 mg/L)与HUVECs及葡萄糖共培养。培养72 h后，各孔加入含0.5% MTT的培养基20 μl，再培养4 h后，弃培养液，加入150 μl DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于490 nm波长处测定吸光值(A值)。实验重复3次，每次3个复孔。
       2.3.2 LDH活性的检测细胞传代培养后随机分为正常组、模型组及各浓度药物作用组，给药剂量及方法同“2.3.1”。实验结束时，收集细胞上清液，按试剂盒方法测定LDH活性。各实验重复3次，每次3个复孔。
       2.4 EJCT对内皮细胞培养液中NO含量的影响取对数生长期细胞消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(2×104cell/孔)，37℃，5% CO2预培养24 h后，更换M199培养液，将细胞分为6组即正常组、EJCT (3，10，30，100 mg/L)、硝普钠 (10 mg/L)组。正常组为HUVECs的自然培养，药物组为不同浓度的药物与HUVECs共培养24 h后，以Griess法[9]测定细胞培养液中NO含量。即100 μl细胞培养液与100 μl的Griess试剂(1%磺胺溶于2.5%磷酸与等体积的0.1%萘乙二胺盐酸盐混合液)在室温下反应10 min，在酶标仪上于540 nm测定吸光度。再根据NaNO2的标准曲线，计算出细胞培养液中NO2-的含量。每次实验为3个平行， 重复实验3次。
       2.5 统计学处理所有实验数据均以±s表示，采用t检验进行组间比较，P<0.05 认为有统计学差异。
       3 结果
       3.1 EJCT对H2O2损伤内皮细胞存活率的影响如图1所示，与正常组比较，模型组A490值极明显降低(P<0.01)。与模型组相比，EJCT 10，30 mg/L组的A490值分别明显和极明显高于模型组(P<0.05，P<0.01)。可见，EJCT 10，30 mg/L明显提高损伤的内皮细胞的存活率。
       3.2 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞SOD活性的影响如图2所示，与正常组比较，H2O2损伤组内皮细胞SOD活性显著降低(P<0.01)。EJCT 3 mg/L组SOD活性显著升高(P<0.05)，EJCT 10，30 mg/L组SOD活性极显著升高(P<0.01)。表明EJCT能明显抑制H2O2所致细胞的脂质过氧化损伤，表现为细胞内SOD活性显著升高。与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，*P<0.05, ** P<0.01图1 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞存活率的影响(±s)与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，* P<0.05, ** P<0.01图2 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞SOD活性的影响(±s)
       3.3 EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响如图3所示，与正常组比较，模型组内皮细胞A490值极明显降低(P<0.01)。与模型组相比，EJCT 3 mg/L组的A490值明显高于模型组 (P<0.05)，EJCT 10，30 mg/L组的A490值极明显高于模型组 (P<0.01)。可见EJCT 3，10，30 mg/L明显提高高糖损伤的内皮细胞的存活率。
       3.4 EJCT对高糖损伤的内皮细胞LDH的影响如图4所示，与正常组比较，高糖损伤组细胞培养液中LDH水平极显著升高(P<0.01)，EJCT 3，10，30 mg/L剂量组极显著降低高糖所致脐静脉内皮细胞LDH释放(P<0.01)。提示EJCT对高糖所致脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，* P<0.05, ** P<0.01图3 EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，**P<0.01图4 EJCT对高糖损伤的内皮细胞培养液中LDH的影响(±s)
       3.5 EJCT对HUVEC细胞培养液中NO含量的影响如图5所示，与正常组相比，EJCT 3，10，30，100 mg/L均极明显增加HUVEC细胞培养液中NO含量 (P<0.01)，其增加百分率分别为8.8%，25.3%，45.9%和105.8%;硝普钠10 mg/L极明显增加HUVEC细胞培养液中NO含量 (P<0.01)，其增加百分率分别为114.3%。与正常组比较，*P<0.05, ** P<0.01图5 EJCT对HUVEC细胞培养液中NO含量的影响
       4 讨论
       MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此能力，因此可以间接反映活细胞的数量[10]。用有机溶剂如DMSO溶解甲臜结晶，然后用酶标仪测定甲臜溶液光密度的A值。相关研究表明，在一定细胞数范围内，甲臜溶液的A值与活细胞数呈正比。从本实验MTT法结果中可以看出, H2O2 和高糖均使内皮细胞损伤，而EJCT具有抗 H2O2诱导和高糖诱导的内皮细胞损伤的作用。
       H2O2能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞，在细胞核内的H2O2可转变成具有高活性羟自由基，从而造成DNA链断裂，导致细胞损伤。H2O2可作为内皮细胞脂质过氧化反应的引发物。SOD是体内重要的抗氧化酶，能特异性地灭活并清除氧自由基，其活性高低可间接反映细胞或机体清除氧自由基的能力[11]。本研究显示H2O2损伤组细胞SOD活性显著降低， 而用EJCT预处理后，各剂量均可提高内皮细胞SOD活性，表明EJCT可能是通过抗过氧化损伤作用减轻H2O2所致的内皮细胞损伤。
       血管内皮细胞出现损伤是糖尿病血管并发症发生的前提，高血糖可引起血管内皮细功能障碍和内皮细胞损伤。目前已有的观点认为，高血糖状态下产生了过多的氧自由基最终导致内皮细胞增殖受到抑制[12]。LDH是细胞损伤后的代谢产物，它的活力反映细胞损伤的程度。本实验中高糖(30 mmol/L)损伤组HUVECs A490值极明显降低，培养液中LDH含量明显升高。这表明高糖能引起内皮细胞氧化损伤，同时也抑制了细胞的增殖代偿能力。而用EJCT预处理后，各剂量均可提高内皮细胞A490值和降低培养液中LDH含量。表明EJCT可明显减轻高糖引起的HUVECs损伤，对血管内皮细胞损伤时的修复具有重要意义。
       NO是由内皮细胞合成的血管活性物质，它能舒张血管平滑肌，抑制异常增殖和炎症反应，以及抑制血小板聚集等作用。可见，内皮源性NO对心血管系统的调控作用是广泛而又明确的，维持正常的NO水平，对心血管保护作用具有重要的意义。2型糖尿病患者常有血管内皮功能异常，已证实在血管内皮功能受损时内皮源性NO表达减少[1]。本实验中EJCT(3，10，30，100 mg/L)均明显增加HUVECs培养液中的NO含量，提示EJCT能促进NO的合成和释放，这也是其保护血管内皮的作用机制之一。
       综上所述，风轮菜乙醇提取物(3，10，30 mg/L)能明显提高H2O2 诱导的和高糖诱导的内皮细胞存活率，使H2O2 损伤的内皮细胞内低下的SOD活力回升，降低高糖诱导的内皮细胞LDH释放。另外，EJCT(3，10，30，100 mg/L)均明显增加HUVEC培养液中的NO含量。可见，风轮菜乙醇提取物具有明显的保护血管内皮细胞作用，其作用机制可能与其抗氧化活性和促进NO的合成与释放有关。鉴于风轮菜乙醇提取物具有降血糖活性，故在防治糖尿病血管并发症方面具有良好的前景。
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