文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的应用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧模型,探讨蝎毒纤溶活性肽(SVFAP)对缺氧损伤内皮细胞的保护作用。方法对培养的HUVECs传代并分组：对照组常规培养;缺氧组将其放入含95% N2、5% CO2混合气体的缺氧环境中培养12 h,制备HUVECs缺氧损伤模型;药物干预组分别将终浓度为2，4，8 mg/L的SVFAP加入细胞培养液中进行培养，1 h后进行缺氧模型复制。观察各组细胞培养上清液中漂浮细胞数、抗凝、纤溶指标等变化。结果与对照组相比,模型组培养液中的漂浮细胞数显著增高,前列环素(6-keto-PGF1α)和NO水平显著下降,组织型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性增高,组织型纤溶酶原激活物(t-PA)活性显著降低; 蝎毒纤溶活性肽在较高剂量组能显著提高6-keto-PGF1α和NO水平、调节PAI-1和t-PA活性。结论实验制备的HUVECs缺氧损伤模型存在着内皮细胞(EC)受损, 纤溶、抗凝功能失调; 蝎毒纤溶活性肽对缺氧环境下受损EC具有保护作用。
       【关键词】  蝎毒纤溶活性肽; 缺氧; 内皮细胞; 前列环素; 组织型纤溶酶原激活物
       在正常情况，EC的促栓促凝与抗栓抗凝处于动态平衡之中，血管内皮细胞分泌众多生物活性物质，它们相互协同，相互拮抗，参与调节血管张力，抗血栓形成，止血，纤溶，维持正常的血液循环。在病理条件下(如缺血缺氧)，血管内皮细胞受损，致使EDRF、PGI2 、t-PA等抗凝纤溶物质的生成/释放减少，促使血管痉挛，血栓形成。
       全蝎作为我国传统名贵药材,具有祛风、止痉、通络、解毒之功效。蝎毒作为其发挥作用的主要成分,能够保护血管内皮细胞而发挥抗凝、纤溶等作用[1]。但其对于缺氧性损伤的血管内皮细胞是否具有同样的保护作用，尚未见报道。笔者在前期研究工作的基础上，以缺氧损伤人脐静脉内皮细胞为受试对象,进一步探讨其纤溶主要成分——蝎毒纤溶活性肽对缺氧损伤内皮细胞的保护作用，以期为拓展其临床应用打下理论基础。
       1 材料与仪器
       1.1 药物与试剂SVFAP(潍坊医学院应用药理研究室提供), M199培养基(GIBCO产品),内皮细胞生长因子(Boehringer Mannheim产品),胶原酶(Sigma产品),组织型纤溶酶原激活剂及其抑制物-1(上海太阳生物试剂公司生产)，NO试剂盒(南京建成生物技术研究所)，6-Keto-PGF1α(北京东亚免疫技术研究所)。
       1.2 仪器CO2培养箱(Format Scientific Co,美国),Multiskan酶标仪(Epson,日本),倒置相差显微镜(上海显微镜厂产品)，SN-682型放免γ-计数器(上海日环核仪厂)。
       2 方法
       2.1 原代内皮细胞的培养方法
       参照文献[2]方法, 在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带25～30 cm，用Hank"s液将脐静脉中残血冲洗干净后,注入体积分数为0.1%的胶原酶消化,于消化下内皮细胞中加入完全培养液(含体积分数为20%胎牛血清,2 mmol/L谷氨酰胺,50 IU/ml青霉素,50 mg/L链霉素,50 μg/L肝素,50 μg/L内皮细胞生长因子及Hapes液的M199培养基),用吸管轻轻吹打,制成细胞悬液,细胞计数为2.0×105L-1,接种入25 cm2平皿中,于CO2培养箱中37℃孵育，待细胞长成融合状态后作细胞鉴定。血管内皮细胞特征：相差显微镜下呈单层铺路石样排列，用免疫法测定第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。确定为内皮细胞后再传代培养，取第3代生长良好的人脐静脉内皮细胞进行实验。
       2.2 内皮细胞缺氧损伤模型制备[3，4]人脐静脉内皮细胞生长至80%以上融合的单层细胞时，消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×105 L-1，分别接种于24孔培养板。24孔板每孔加入200 μl细胞悬液，次日换液，第3天进行造模。吸去板中培养液,用PBS冲洗3次,加入不含胎牛血清的培养液,置入自制的密闭缺氧罐中，持续通入混合气体(含95% N2、5% CO2)3 L/min,置换容器中的氧气。待该容器内氧气分数低于1%后，停止通气，置37℃ 孵箱中培养12 h，造成缺氧模型。全量收集该EC上清液,离心(1 0 000 g×3 min)除去培养液中的细胞碎片,置-20℃冰箱备用。
       2.3 实验分组与药物干预实验随机分为：①正常对照组：更换无小牛血清的培养液(2 ml),置于37℃体积分数0.95 O2+0.05 CO2的培养箱中正常培养12 h，按上述方法,收集培养液。②缺氧模型组：制备缺氧模型，置于体积分数0.95的N2+0.05的CO2缺氧环境12 h。③药物干预组：分为3个小组(分别称低、中、高剂量组)，更换含SVFAP培养液中培养,培养液中SVFAP终浓度分别为2，4，8 mg/L，正常培养1 h后放入含95% N2、5% CO2混合气体的培养缸内(缺氧环境),余同缺氧组处理，每组8孔。
       2.4 指标检测及方法观察细胞形态及培养上清液中的漂浮细胞情况。取各组培养液, 采用发色底物法测定组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI)活性;采用放免法测定前列环素稳定代谢产物6-keto-PGF1α;采用酶法测定NO水平。具体检测方法主要参照试剂盒说明书进行。
       2.5 统计学方法结果以±s表示,各组间差异比较用方差分析。
       3 结果
       3.1 各组细胞培养上清液中漂浮细胞和6-keto-PGF1α、NO水平的变化表1显示,模型组在缺氧12 h后,漂浮细胞数显著高于对照组,表明缺氧后EC受损。与模型组相比, SVFAP组可显著降低漂浮细胞数,表明其对细胞在缺氧环境下的生长具有保护作用。模型组在缺氧12 h时,6-keto-PGF1α和NO的量显著低于正常组,表明模型组缺氧后EC受损,分泌抗凝因子功能降低。与模型组相比, SVFAP组可显著提高6-keto-PGF1α和NO的水平,提示SVFAP能改善EC缺氧受损后的抗凝功能。表1 各组细胞上清液中漂浮细胞数及6-keto-PGF1α和NO水平
       3.2 蝎毒纤溶活性肽对培养人脐静脉EC t-PA和PAI活性及其二者比值的影响以发色底物法测定内皮细胞培养液中t-PA和PAI-1的活性。由表2可见,模型组在缺氧12 h时, t-PA活性显著低于对照组,而PAI-1活性高于对照组, t-PA/PAI-1的值下降;与模型组比较,SVFAP组在较高剂量组能显著提高t-PA/PAI-1的比值。提示模型组缺氧后EC受损,分泌功能失调,纤溶功能减弱。SVFAP组可调节PAI-1与t-PA活性,改善纤溶功能。表2 各组细胞上清液中t-PA、PAI-1活性及二者比值
       4 讨论
       许多疾病(如心肌梗塞和脑梗塞)都会引起机体缺氧, 缺氧可直接损伤血管EC，形态学上主要表现为线粒体肿胀、空化、嵴结构不清， 高原缺氧可使居民的血管EC易衰老和脱落。此外对血管EC合成、释放纤溶、抗凝等因子的功能也有损伤作用;血管EC在缺氧后可增加与血小板、血细胞的黏附性,增高血液凝固性。对于心脑血管缺血性疾病来讲,保护血管EC免受缺血缺氧性损伤具有十分重要的意义。
       体外培养血管EC有贴壁生长的特性,而一旦EC受到缺氧等损害,就会影响它的部分功能,最终使其坏死漂浮[5]。本实验研究结果表明:人脐静脉原代EC缺氧损伤模型与对照组相比,模型组培养液中的漂浮细胞数显著增高,这表明本实验制备的人脐静脉EC缺氧损伤模型存在着内皮细胞受损。
       t-PA和PAI-1是血管内皮细胞分泌的纤溶系统活性关键物质。t-PA激活纤溶酶原转变为纤溶酶发挥抗栓作用。PAI-1被认为是血栓性疾病的一种危险因子,且对t-PA有快速抑制作用,二者的动态平衡对调节机体纤溶功能起着决定作用。任何影响t-PA和PAI-1动态平衡的因素都能影响纤溶和抗栓作用。此外,PAI-1是血栓性疾病的一种危险因子,在缺血性疾病中起重要作用,升高的PAI-1能够影响溶栓药物的疗效。前列环素(PGI2)主要由血管内皮细胞合成,很不稳定,半衰期只有几分钟,其稳定的代谢产物是6-keto-PGF。EC的PGI2合成酶能利用在EC附近或在EC上的血小板所释放的内过氧化物合成PGI2，其主要作用是抑制血小板的粘附与聚集，拮抗血栓烷A2，使血管扩张。同时EC是体内合成NO的主要细胞，NO除了松弛平滑肌以外，进入血液的NO可抑制血小板聚集，抑制血小板粘附于血管内皮下层的胶原等基质，使聚集的血小板解聚。血小板在受损血管内皮下的粘附及积聚是血栓形成的重要启动因素之一，而NO和PGI2对抑制血小板激活具有协同作用，能更好地抑制血液凝固。
       本实验研究结果表明，人脐静脉EC缺氧损伤模型与正常对照组相比,模型组PAI活性显著增高,t-PA活性显著降低; 6-keto-PGF1α和NO的量显著下降;表明在本实验制备的人脐静脉EC缺氧损伤模型中，由于内皮细胞受损,其分泌功能失调，减弱了内皮细胞的抗凝和纤溶功能。蝎毒纤溶活性在治疗心脑血管缺血性疾病中取得了满意的效果，本研究发现蝎毒纤溶活性肽可显著降低漂浮细胞数,显著提高6-keto-PGF1α、NO的水平,调节PAI-1与t-PA活性，提示蝎毒纤溶活性肽对EC在缺氧环境下的生长具有保护作用,改善EC分泌功能的失调,增强了其抗凝与纤溶功能。此可能是蝎毒有效成分治疗缺血性心脑血管疾病的机制之一。
       【参考文献】
         　[1] 王巧云,吕欣然.蝎毒纤溶活性肽对血管内皮细胞分泌纤溶因子的影响[J].现代中西医结合杂志，2004，13(11)：1434.
       
       [2] 鄂 征.组织培养和分子生物学技术[M].北京:北京出版社,1995:126.
       
       [3] 李江津，刘正湘.人参皂苷Rb1对缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡的影响[J].临床心血管杂志，2005，21(12)：728.
       
       [4] 沈建颖，孙爱军，张庆华，等.银杏叶提取物主成分总黄酮对缺氧致内皮功能障碍的保护作用[J].中国临床医学，2008，15(1)：5.
       
       [5] 胡大林,廖建坤,吴校连,等.自由基与DNA的氧化损伤[J].国外医学·卫生学分册, 2002, 29(5): 261.