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       【摘要】 
       目的探讨穴位埋线治疗类风湿性关节炎(RA)的可能机制，为穴位埋线治疗RA在临床上的运用提供新的理论和实验依据。方法采用弗氏完全佐剂(FCA)复制出佐剂性关节炎(AA)大鼠模型，将SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、穴位埋线组。选用足三里、肾俞穴采用穴位埋线的方法进行治疗。应用免疫组织化学的方法，检测MMP-2、MMP-9在局部关节滑膜组织中的表达。结果治疗后，与模型组比较，埋线组AA大鼠滑膜细胞MMP-2、MMP-9的平均光密度值显著增高(P<0.05)，免疫阳性细胞数显著减少(P<0.01)。结论穴位埋线通过下调MMP-2、MMP-9的表达，减轻其参与或介导的对滑膜组织造成的损害，从而控制关节滑膜炎，阻止关节软骨和骨损害的发生。
       【关键词】  埋线; 佐剂性关节炎; 基质金属蛋白酶-2; 基质金属蛋白酶-9
       类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病[1]，RA关节破坏的机制尚不完全清楚。近年研究证实，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用[2，3]，可降解一种或几种细胞外基质 (Extracellular matrix，ECM)，ECM的失调能引起病理上损伤导致关节炎。其中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是水解ECM，导致关节破坏的关键酶[4]。本研究建立与RA病理变化基本相似的佐剂性关节炎(Adjuvant Arthriti，AA)大鼠模型，观察穴位埋线对AA大鼠滑膜细胞MMP-2、MMP-9表达的影响及对病理组织的改变的影响，初步探讨穴位埋线治疗RA的可能机制。目前作者未见相关文献报道，现将我们的结果报告如下。
       1 材料与仪器
       1.1 动物30只健康SD大鼠，体质量(200±20)g，雌雄各半，由贵阳医学院动物饲养中心提供[合格证批号为SCXK(黔)2002-0001]。饲以标准育成饲料(贵阳医学院动物饲养中心提供)，自由饮水。
       1.2 主要仪器与试剂光学显微镜 Leica DFC280，切片机 Leica2135，弗氏完全佐剂(美国sigma公司生产，批号045k8910)，MMP-2、MMP-9一抗、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。
       2 方法
       2.1 分组及造模动物造模前在相同光照条件适应性喂养1周。随机分为正常对照组(对照组)、AA模型组(模型组)、穴位埋线治疗组(埋线组)，每组10只，雌雄各半。各组相同条件下喂养，自由摄食，饮水。室温控制在15～18℃，湿度70﹪左右。对照组在右侧后肢足垫皮下注射0.1ml生理盐水。模型组与埋线组参照文献[5]造模，选用复制类风湿性关节炎的经典模型：弗氏完全佐剂(Freund"s complete adjuvan，FCA)诱导的AA大鼠模型。具体方法为：实验开始第1天，在大鼠右侧后肢足垫皮下注射0.1ml FCA。
       2.2 治疗方法从造模后第15天开始治疗。埋线组依照文献[6]行穴位埋线法：将大鼠俯卧位固定，外展拉直后肢，将已预先置入0.8cm长无菌羊肠线的9#针头，刺入已常规消毒的双侧“足三里”及“肾俞”穴(取穴依照华兴邦研制的大鼠穴位图谱[7])，将肠线完全置入穴内。治疗时间共28 d，埋线两次，每14天一次。空白组和模型组不作治疗。
       2.3 标本采集治疗后的第29天腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100g麻醉。无菌条件下完整取出右侧后肢跖趾关节，剔净软组织，用PBS缓冲液冲洗后，用0.1 mol/LPBS缓冲液配制的4%多聚甲醛固定。固定24h后，用EDTA-2Na溶液进行脱钙，脱钙时间40 d。以大头针能轻轻刺入为脱钙成功的标准。然后依次将标本脱水、透明、浸蜡、包埋、连续纵向切片 (切片厚度为4μm)，切片分别用HE病理染色和免疫组化检测。
       2.4 跖趾关节病理切片用HE染色。切片用二甲苯脱蜡(3次，10～15 min/次)，80%、90%、100%的乙醇洗二甲苯后(5 min/次)，于苏木素液中染色10～15 min(染细胞核)，自来水洗，0.5%盐酸酒精速洗，自来水洗，0.1%～0.2%氨水速洗，自来水洗，0.5%曙红Y染色1 min，自来水洗，再用80%、95%、100%酒精脱水固定(速过)，二甲苯透明(两次，5～10 min)，封片，阅片，拍照。
       2.5 MMP-2、MMP-9免疫组织化学染色采用SABC免疫组化染色法测定。组织切片经常规脱蜡、脱水;3%H2O2室温 10 min;蒸馏水洗5min×3次。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，高压加热沸腾后再加热2 min，冷却。滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加兔抗MMP-2、MMP-9抗体(稀释浓度为1︰50)，湿盒4℃冰箱过夜。PBS洗5 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min。PBS洗5 min×3次。滴加试剂SABC，37℃孵育20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染后，脱水，透明，封片。
       2.6 图像分析及统计学处理 在显微镜下观察，拍片，采用 Biomias99图像分析系统对平均光密度和免疫阳性细胞数进行图像分析。在40×10倍光学显微镜下，采集大鼠滑膜组织免疫组化图像并输入图像分析系统进行分析。每张切片随机选取5个视场，每个视场选取5个阳性表达区域测量平均光密度值并用鼠标点击法计数阳性细胞数。计量资料以±s表示，各组间差异采用方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD检验，采用SPSS(12.0版)统计软件包进行统计。
       3 结果
       3.1 各组大鼠滑膜细胞MMP-2平均光密度和免疫阳性细胞数的比较与正常对照组比较，模型组MMP-2平均光密度值明显降低，免疫阳性细胞数明显升高，有统计学意义(P<0.0l);与模型组比较，埋线组MMP-2平均光密度值上升，免疫阳性细胞数明显下降，有统计学意义(P<0.05或P<0.0l)。见表1，图1～3。
       3.2 各组大鼠滑膜细胞MMP-9平均光密度和免疫阳性细胞数的比较与正常对照组比较，模型组MMP-9平均光密度值明显降低，免疫阳性细胞数明显升高，有统计学意义(P<0.0l);与模型组比较，埋线组MMP-9平均光密度值上升，免疫阳性细胞数明显下降，有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2、图4～6。表1 各组大鼠滑膜细胞MMP-2平均光密度和免疫阳性细胞数的比较图1 正常对照组大鼠滑膜细胞 图2 模型组大鼠滑膜细胞MMP-2免疫组化染色(400×) MMP-2免疫组化染色(400×)图3 埋线组大鼠滑膜细胞MMP-2免疫组化染色(400×)　　表2 各组大鼠滑膜细胞MMP-9平均光密度和免疫阳性细胞数的比较图4 正常对照组大鼠滑膜细胞 图5 模型组大鼠滑膜细胞MMP-9免疫组化染色(400×) MMP-9免疫组化染色(400×)
       图片结果显示，MMP-2、MMP-9阳性细胞主要分布于滑膜部位，阳性反应物呈棕黄色，定位于细胞胞浆，细胞核呈阴性。对照组大鼠几乎没有MMP-2、MMP-9阳性细胞表达;AA大鼠滑膜细胞MMP-2、MMP-9阳性细胞广泛表达于细胞胞浆，染色较深;埋线组MMP-2、MMP-9阳性细胞明显减少，染色较浅。
       3.3 各组大鼠跖趾关节病理切片HE染色，对照组大鼠滑膜组织无充血水肿，未见滑膜增生，无炎性细胞浸润。模型组大鼠滑膜充血、水肿明显，并有大量的炎性细胞的浸润，滑膜细胞增生，滑膜层数增加。埋线组大鼠滑膜充血水肿得到改善，炎性细胞的浸润得到缓解，滑膜细胞增生有所改善，滑膜层数有减少的趋势(见图7～10)。图6 埋线组大鼠滑膜细胞MMP-9免疫组化染色(400×)图7 正常对照组 图8 模型组大鼠滑膜组织HE染色(200×) 大鼠滑膜组织HE染色(200×)图9 模型组大鼠滑膜 图10 埋线组大鼠滑膜组织HE染色(200×) 组织HE染色(200×)
       4 讨论
       现代医学研究认为类风湿性关节炎以慢性滑膜增生为特点，表现为滑膜衬里层细胞增生、炎性细胞浸润以及滑膜下层血管生成，进而导致关节组织包括肌腱、关节囊、软骨和骨进行性和不可逆性破坏和功能障碍。有关RA关节软骨、骨质破坏的机制及其细胞和分子基础是该病研究的焦点。近年来有研究显示基质金属蛋白酶(MMPs)参与关节软骨及骨组织降解、破坏[2，3]。
       MMPs是一族锌离子依赖的内源性蛋白酶，它们可降解一种或几种细胞外基质 (ECM)，在有机体生长发育中的ECM逆转与重塑以及疾病的病理损害中起着极为重要的作用[8]。MMP-2、MMP-9属于明胶酶，是水解细胞外基质(ECM)导致关节破坏的关键酶[4]，可以降解ECM中的I型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型及Ⅺ型胶原和纤维结合素(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)及蛋白多糖，而这些成分也是关节软骨的重要组成成分。有研究表明，滑膜关节的破坏主要是由于滑膜衬里层(A型和B型滑膜细胞)，软骨细胞和浸润的炎症细胞高表达MMP-2和MMP-9引起的[9];最近有报道：RA患者破坏关节局部滑膜细胞MMP-2、MMP-9表达增加，进一步证实了二者在骨侵蚀中的作用[10]。由于滑膜中MMP-2、MMP-9是导致关节病理损伤的重要因素之一，因此，抑制MMP-2、MMP-9的产生可作为治疗RA的靶点。
       类风湿关节炎，属祖国医学“痹证”“顽痹”范畴。历代医家均认为本病的病机特点是本虚标实，虚实夹杂。本虚为气血、阴阳、脏腑亏损，标实为外受风寒湿热之邪，内生痰浊瘀血之患。针灸运用于痹证的治疗，是自古以来行之有效的方法之一，具有调和气血阴阳、疏经通络止痛的作用。穴位埋线是集经穴、针刺和线的作用，将古老传统针灸术和近现代组织疗法融为一体的治疗方法[11]。根据痹证的病因病机特点，其施治脏腑主要在脾(胃)肾，治疗上应标本兼顾，以益肾为主，兼以祛风散寒除湿。肾俞是肾的背俞穴，是肾脏之气输注之处，内通肾脏，能益肾固精，具有滋肾阴，温肾阳，补虚培元之功[12]。足三里是是胃经合穴，胃的下合穴，有调理脾胃、扶正固本、祛风利湿、通经活络之效[12]。故本实验选取“肾俞”与“足三里”穴位埋线，通过肾俞培元固本而扶正祛邪，使“邪不可干”，勿因邪因虚致瘀，再通过足三里的理气活血，祛风利湿，通经活络作用，以达到治疗目的。
       本研究结果显示，模型组较正常对照组MMP-2、MMP-9 表达增高，与国内外学者报道相一致。埋线组大鼠滑膜细胞MMP-2、MMP-9阳性细胞数明显下降(P<0.0l)、平均光密度值上升(P<0.05)。病理切片显示，埋线组大鼠滑膜充血水肿得到改善，炎性细胞的浸润得到缓解，滑膜细胞增生有所改善，滑膜层数有减少的趋势。本研究说明采用穴位埋线“足三里”、“肾俞”穴的治疗方法能够下调滑膜细胞MMP-2、MMP-9的表达，这可能是穴位埋线控制滑膜炎症的发生，阻止软骨及骨的破坏，从而治疗RA的作用途径之一。
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