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       【摘要】 
       目的测定肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌膜蛋白浓度。方法蔗糖梯度离心法对肺动脉平滑肌膜蛋白进行提取;二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法测定膜蛋白浓度;G-6-Pase定量试剂盒测定平滑肌肌浆网(SR)标志酶G-6-Pase活性。结果经测定MCT组和对照组G-6-Pase活性分别为(19.5±2.41)IU/g和(18.35±2.21)IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆G-6-Pase活性(1.23±0.14)IU/g和(1.15±0.17)IU/g;测定波长为595 nm，在0.025～0.5 mg/ml时，线性关系良好，r=0.997 6。结论提取的SR有较高纯度;BCA法可以用于平滑肌SR膜蛋白浓度的测定。
       【关键词】  野百合碱; 肺动脉高压; SR; BCA法
       目前测定蛋白浓度有很多种方法，其中二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowry法相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与Lowry法相比，BCA法灵敏度高、操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是受杂质的影响较小，故本文选用BCA法对提取的样品进行蛋白浓度测定。
       1 材料与仪器
       1.1 动物健康成年Wistar大鼠，雄雌兼用，250～300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。
       1.2 试剂 野百合碱(MCT)、Tris、马来酸、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(美国Sigma公司);抑肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)(Amresco Solarbio公司);BCA蛋白测量试剂盒(北京天来生物医药科技有限公司);葡萄糖-6-磷酸酶定量试剂盒(广州天河天一医药保健品公司);其它试剂均为国产分析纯。
       1.3 仪器ULTRA. Pro 80 型高速低温离心机(美国SORVALL公司); 7170A型全自动生化分析仪(日本日立公司);ELX-800型酶标仪(美国宝特公司)。
       2 方法
       2.1 溶液的制备[1]
       2.1.1 匀浆液30 mmol·L-1 Tris-马来酸(Tris-maleate)，3.0 mol·L-1蔗糖，3 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)，1 μmol·L-1胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)，1 μmol·L-1亮肽素(leupeptin)，2.4 U抑肽酶(aprotinin)，0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)，1 μmol·L-1抗坏血酸钠(Nasocorbate)，pH 7.2。
       2.1.2 萃取液30 mmol·L-1 Tris-maleate， 0.3 mol·L-1蔗糖， 0.6 mol·L-1 KCl，1 μmol·L-1 leupeptin，0.1 mmol·L-1 PMFS，pH 7.2。
       2.1.3 储存液30 mmol·L-1Tris-maleate，0.3 mol·L-1蔗糖，1 μmol·L-1leupeptin， 0.1 mmol·L-1 PMSF，pH 7.2。
       2.1.4 BCA“工作液”按50体积BCA试剂A溶液加1体积BCA试剂B溶液配制，充分混匀备用。
       2.2 大鼠肺动脉高压的建立[2]健康成年Wistar大鼠腹腔一次性注射MCT生理盐水溶液(60mg·kg-1)，饲养21 d后取出肺和心脏。剪下右心室，左心室、分离室间隔，称重，计算右心室/(左心室+室间隔重量)[RV/(LV+S)]之值。
       2.3 SR的提取及纯度鉴定
       2.3.1 SR的提取参照文献[3]采用差速离心法制取肺动脉SR。正常与PAH大鼠各10只，雄雌不限，体质量250～300 g。无菌生理盐水配成20%乌拉坦溶液，按0.5 ml/100 g体重的剂量进行腹腔麻醉，麻醉后快速开胸取出心肺组织，分离肺动脉上的结缔组织，尽可能向肺内部延伸，剪断取出，立即置于-80℃保存。
       取冻存的MCT组和对照组肺动脉，称重为0.669 5 g和0.252 7 g。按照重量∶体积(V/W)=1∶5加入0℃左右的匀浆液冲洗。然后将肺动脉快速切碎(<1mm3)，匀浆，完毕后收集匀浆液于冷冻离心试管中，低速离心(3 800×g，20 min)，所得上清液用于制备SR。
       取上清液高速离心(4℃，12 000×g，20 min)，离心毕收集上清液于-80℃保存。
       将离心后保存的上清液解冻，倒入低温高速离心试管中，冷冻高速离心机离心30 min(4℃，143 000×g)。倾去上清液，保留沉淀，分别加入6 ml萃取液，充分振荡，使其混匀。配平，在原来转速、温度不变的情况下，离心45 min。离心毕，倾去上清液，保留沉淀，称重记录。
       离心管中加入储存液各5 ml，振荡混合均匀，转移至提前准备好的青霉素小瓶中，分装后以超低温冰箱速冻，-80℃保存。
       2.3.2 SR的纯度鉴定[4]利用7170A型全自动生化分析仪和G-6-Pase定量试剂盒，对经蔗糖差速离心法提取的对照组和MCT组SR标本中SR标志酶G-6-Pase活性进行检测。
       2.4 BCA法测蛋白浓度取试剂盒中蛋白标准品-牛血清蛋白10μl，用0.9%生理盐水90 μl稀释，使终浓度为0.5 mg/ml，此即为标准品稀释液。
       取标准品稀释液按1，2，4，8，12，16，20 μl加入到96孔平板的标准品孔中，加0.9%NaCl补足到20 μl。
       另取上述MCT组及对照组SR的制备品各10 μl加入到96孔板的样品孔中，亦加0.9%NaCl补足到20 μl。
       标准品孔和样品孔各加入200 μlBCA工作液，轻微振荡，混匀于37℃恒温水浴中温育30 min。取出平板于酶标仪上测吸光度，测定波长为570 nm和595 nm。
       3 结果
       3.1 大鼠肺动脉高压的建立见表 1。MCT组右心室/(左心室+室间隔重量)与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，说明注射MCT大鼠右心室肥厚，具有明显的肺动脉高压的病理生理改变。表1 MCT 和对照组 RV/(LV+S)
       3.2 提取的SR纯度见表2。从表2中数据中可以看出提取的SR有较高的纯度。表2 标志酶G-6-Pase活性
       3.3 测定的蛋白浓度以吸光度为纵坐标(Y)、标准品质量为横坐标(X)，进行回归运算( 图1～2)，求得曲线方程分别为Y=1.71×10-2X+8.00×10-3，r=0.983 8;Y=4.74×10-2X+3.80×10-3，r=0.997 6。
       当波长为595 nm时，吸光度与标准品质量相关系数好，r为0.997 6。故选用波长为595 nm的方程。经计算MCT组和对照组SR的制备品重量分别为12.282 7 μg和6.797 5 μg，则浓度分别为0.614 3 μg/μl和0.339 9 μg/μl。此数据说明提取的SR蛋白浓度较高。图1 570nm处标准品质量与吸光度关系曲线方程图2 590nm处标准品质量与吸光度关系曲线方程
       4 结论
       通过以上数据，MCT组右心室/(左心室+室间隔重量)与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，说明注射MCT大鼠右心室肥厚，具有明显的肺动脉高压的病理生理改变;经测定MCT组和对照组G-6-Pase活性分别为(19.5±2.41)IU/g和(18.35±2.21) IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆G-6-Pase活性(1.23±0.14)IU/g和(1.15±0.17)IU/g，说明提取的SR有较高的纯度;当波长为590 nm时，线性关系良好。通过计算结果表明用以上的方法提取，比较可靠，方法可行。
       MCT是野百合科植物野百合中提取的生物碱，本身没有活性，通过给大鼠皮下注射，在肝脏中代谢形成具有生物活性的脱氢产物-野百合碱吡咯，后者在血流通过肺脏时沉积于肺小动脉壁及肺毛细血管。血管内皮细胞(Ec)覆盖管腔60%～70%的内表面，其生理作用不只是单纯的血管内衬。近年来的研究表明，内皮是一个代谢极为活跃的组织，它可合成多种血管活性因子，在受到MCT损伤时，这些活性因子会发生改变，引起继发性的血管构型改变，从而导致肺动脉压升高，所以MCT腹腔注射法是建立肺动脉高压模型的常用方法
       【参考文献】
         　[1] 吴 乐，张缪佳，高 蓉，等.骨骼肌型ryanodine受体放射配基分析法的建立[J].中华 核医学杂志， 2003，23(3):171.
       
       [2] 孙燕妮，刘忠令.野百合碱诱发肺动脉高压大鼠血管活性物质的变化[J].中国药理学通报， 2001，17(5):573.
       
       [3] Valdivia H， Fuentes O， Elhayek R，et al. Activation of the ryanodine receptor Ca2+ release channel of carcoplasmic eticulum by a novel scorpion venom[J].Bial Chem，1991，266:19135.
       
       [4] 承 伟，叶兆伟，王佩琪，等.肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌RyR结合特性及基因C-末端序列的研究[J].中国药理学通报，2008，24(10):1306.