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       【摘要】 
       目的分离、鉴定毛冬青(Ilex pubescens )中的酸性、酚性、皂苷类化学成分。方法采用水提、醇沉 、醋酸乙酯萃取或乙醇提取，硅胶柱色谱方法进行分离，得到11个化学成分，运用IR、UV、MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱法鉴定化合物结构。结果分离鉴定了11个化合物： 3，4-二羟基苯甲醛 (1);decumbic acid(2);富马酸(3);3，4-二咖啡酰鸡纳酸(4);琥珀酸(5);ilexgenin A(6)，毛冬青皂苷B1(7);毛冬青皂苷B2(8);毛冬青皂苷甲(9);毛冬青酸(10)和β-谷甾醇(11)。结论化合物2～5是首次从该植物中分得，其中化合物2为首次从高等植物中获得，化合物10是首次从天然产物中获得，根据DEPT碳谱，首次对其碳信号进行了归属。
       【关键词】  毛冬青; 有机酸; 酚性化合物; 皂苷
       Chemical Constituents of Ilex pubescens
       ZENG Xianyi1,
       LI Yuyun1,
       XU Xiaoyan1,
       LI Huoru2,
       WU Di1,
       LI Yan1,
       WANG Lijing1
       (1.Jiangxi Institute of Materia Medica ,Nanchang 330029,China;2. Jiangxi Yintao Pharmaceutical Co. Ltd.,Fuzhou 344100，China)
       Abstract：ObjectiveTo isolate acidity,phenolic、tritepene saponins from the roots of Ilex pubescens and to identify their structures.
       MethodsThe compounds were isolated by solvent extract and silica gel chromatography and their structures were determined by IR, UV, MS,1H NMR,13C NMR etc..
       ResultsEleven compounds were isolated from Ilex pubescens.They were identified as protocatechuic aldehyde(1)，decumbic acid(2)，fumanric acid(3)，3，4-dicaffeoyl-quinic acid(4)，succinic acid(5)，ilexgenin A(6)，ilexsaponin B1(7)，ilexsaponin B2(8)，ilexsaponin A1(9)，ilexolic acid(10)andβ-sitostrol(11).
       ConclusionCompounds(2～5)was obtained from the plant for the first time，in which (2)was first isolated from higher plant,and (10)was obtained from the natural product for the first time and its 13CNMR signal was assigned by DEPT.
       Key words： Ilex pubescens; Organic acids; Phenolic; Tritepene saponins
       毛冬青为冬青科植物毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.的干燥根，分布于我国南方各省，它具有活血通脉、 消肿止痛、 清热解毒功效，在临床上主要用于治疗脉管炎和冠心病等，有较好疗效，我们在对其有效成分进行研究时，从根的水提、 醇沉 、醋酸乙酯提取部位，分离到3个酸性成分、2个酚性成分，从根的乙醇提取部位分离到6个皂苷类成分。根据其理化性质并综合运用光谱技术分别鉴定为：3，4-二羟基苯甲醛(1);decumbic acid(2);富马酸(3); 3，4-二咖啡酰鸡纳酸(4);琥珀酸(5);ilexgenin A(6)，毛冬青皂苷B1(7);毛冬青皂苷B2(8);毛冬青皂苷甲(9),毛冬青酸(10)和β-谷甾醇(11)。化合物(2)～(5)是首次从该植物中分得，其中化合物(2)最早是从青霉菌Penicillum decumbea的代谢物中得到，此后又从肉桂枝枯病菌Lasiodiplodia theobromae的代谢物中获得[1]，本文是首次从高等植物中获得，化合物(10)是首次从天然产物中获得，结合DEPT碳谱，首次对其碳信号进行了归属。
       1 仪器与材料
       熔点用Yanaco显微熔点仪测定;IR用Shimadau-400或 Spectrum One 红外光谱仪测定;UV用PE lambda 12紫外光谱仪测定; MS用VG ZAB-2F 质谱仪测定;HRMS用Autospec - UltimaETOF质谱仪测定;1H-NMR和13C-NMR用INOVA-500、buruck-400、vns-600核磁共振仪测定。薄层色谱和柱色谱硅胶(160～200目)为青岛海洋化工厂产品。溶剂均为分析纯。实验药材采于江西大茅山，由江西省药物研究所朱良辉副研究员鉴定为毛冬青(Ilex pubescens Hook.et Arn. )。
       2 方法
       2.1 酚酸成分的提取分离取毛冬青根粉碎(25 kg)，加水煎煮3次，每次2 h，合并煎液，浓缩，加入乙醇使含醇量达到70%，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，用10%HCl调pH至3.0，静置，离心。上清液用醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯液，回收溶剂，残留物用热水提取5次，合并水提取液，冷藏一夜，滤过，滤液再用醋酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收溶剂，得固体物。取固体物上聚酰胺柱层析，依次用水、30%，50%乙醇洗脱，蒸干。水洗部分经硅胶柱层析得成分(2)，(3)，(5);30%洗脱部分经硅胶柱层析和苯重结晶得成分(1)，50%洗脱部分经硅胶柱多次层析得成分(4)。
       2.2 皂苷的提取分离取毛冬青细枝、叶，0.6 kg，加水煎煮，浓缩，乙醇沉淀，滤过，滤液挥去溶剂，残留物加少量水稀释，用盐酸调pH至3，用醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯萃取部分回收溶剂后经硅胶柱层析，依次用石油醚∶醋酸乙酯∶甲酸(6∶4∶0.01)、(2∶8∶0.01)和醋酸乙酯洗脱，后者得化合物(9)。取毛冬青根7 kg，粉碎，同上处理，得醋酸乙酯萃取部分，回收溶剂后经硅胶柱层析，石油醚：醋酸乙酯(7∶3)和(1∶1)洗脱，前者得(10)粗品，乙醇重结晶得化合物成分(10)，后者得成分(6)粗品，乙醇重结晶得化合物(6)。取毛冬青根4.2 kg，粉碎，加80%乙醇回流提取，合并提取液，回收溶剂，残留物离心，取沉淀物进行硅胶柱层析，依次用石油醚 ：醋酸乙酯(8∶2)、(1∶1)和乙醇洗脱，(8∶2)洗脱部分得化合物(11)、(1∶1)洗脱部分得(6)粗品，乙醇重结晶得纯品，乙醇洗脱部分回收溶剂后，经反复柱层析，以醋酸乙酯：甲醇(95∶5)～(80∶20)洗脱，得化合物(7)、(8)。
       3 结构鉴定
       3.1 化合物1浅黄色片状或针状结晶，mp 155～156℃(毛细管封闭法),三氯化铁和2，4-二硝基苯肼反应阳性。IRνKBrmax (cm-1)：3210(缔合羟基、宽峰)，1650(羰基)，1 590、1 535、1 440(苯环)及870、810、750(苯环芳氢)。UVλ MeOHmax nm：205，231，280 ，312。MS：m/z 138(M+),137(M-1)，109(M-29),91,81,63,53。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：6.85(1H,d,J=8Hz),7.24(2H,m ),9.63(1H,s)。13C-NMR (CD3OD,125MHz) δ：115.30，116.22，126.43，130.84，147.21，153.74(苯环)，193.07(醛基)。根据以上理化性质及光谱数据并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为3，4-二羟基苯甲醛，即原儿茶醛。
       3.2 化合物2白色结晶，mp 136～137℃;在薄层板上显有机酸反应;IRνKBrmax (cm-1)：3 500～2 300 (宽峰，缔合-OH)， 1 700(>C=O)，1 650(>C=C<)1 460，1 410，1 372，1 330，1 190，1 140，1 125，1 038，1 010，940，875，750，700。UVλMeOHmax nm：220。 MS m/z： 184(M+)，166(M-18),155(M-29)，142(M-42)，124，113，96，71，67，55。HRMS m/z：184.073 200 (计算值184.073559)，得分子式C9H12O4，不饱和度为4。根据1H-1H COSY、HMQC，对相关信号进行了归属，1H-NMR(500MHz ,CD3OD)δ 5.095(1H,br，d，H-4)，1.522(1H，m，H-5)，2.033(1H，m，H-5)，1.361(2H，m，H-6),0.902 (3H，t，J=7.5Hz，H-7) 、2.080(3H，s，H-8);13C-NMR(125MHz，CD3OD)δC175.17(C1)137.36(C2)，150.69(C3)，82.99(C4)，35.75(C5)，19.15 (C6)，14.10(C7)，10.66(C8)，164.79(C9)。以上理化性质及光谱数据与文献[1]中decumbic acid一致，故鉴定为 decumbic acid。
       3.3 化合物3白色结晶，200℃以上升华。在薄层板上显有机酸反应。IR ν KBrmax (cm-1)：3 080(宽峰，缔合-OH),1 680 (-COOH)。UVλ MeOHmaxnm：211 。MS m/z： 116(M+)，98(M-18)，88(M-28)，81，72，53。1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ 6.697。 13C NMR(125MHz，CD3OD) δ135.185，168.036。 根据以上理化性质及光谱数据并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为富马酸，即反式丁烯二酸。
       3.4 化合物4浅黄色颗粒，IRνKBrmax(cm-1)：3 360(OH)，1 700(-COOH)， 1 595， 1 520(Ar)，1 442，1 350，1 270，1 150，1 030，970。UVλMeOH max nm：210，235，245，300，328。MS m/z： 539[M+Na]+， 517[M+1]，499。1H-NMR(500MHz ,CD3OD)δ：6.14、6.24(2×1H,d，J=16.0， C8′-H),6.68，6.69(2×1H,d，J=8.0, C5′- H)，6.85,6.86(2×1H,dd，J=8.0, J=2.0, C6′-H), 6.94, 6.96(2×1H,d， J=2.0, C2′-H),7.47,7.55(2×1H, d，J=16.0，C7′-H)，2.04(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),2.16～2.20(2H,m，C2-H), 2.25(1H,dd，J=14.0，4.0，C6-H),4.31(1H,，dd,J=8.5，3.0，C5-H), 5.06(1H,dd,J=8.5，3.0，C4-H),5.55(1H,m， C3-H)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz),鸡纳酸部分δ:C1 75.95， C2(39.24或38.37)，C3(68.97)，C4( 69.22)，C5(75.60)，C6( 39.24)，176.73为C1上的 -COOH, 咖啡酸部分：C1 ′(123.16),C2′( 114.65)，C3′(149.70)，C4′(146.78)，C5′(115.12)， C6′(127.63)，C7′(147.73或147.61)， C8′(114.70或116.46)，C9′(168.55 或168.20)。以上数据与文献[2] 中3，4-二咖啡酰鸡纳酸一致，故鉴定为3，4-二咖啡酰鸡纳酸。
       3.5 化合物5白色结晶，mp 191～193℃;在薄层板上显有机酸反应;IRνKBrmax (cm-1)：3 600～2 300(宽峰，缔合-OH)， 1 680(>C=O) ，1 410，1 300，1 195。根据以上理化性质及红外光谱数据，并与SADTLER标准光谱比较，鉴定为丁二酸，即琥珀酸。
       3.6 化合物6无定形粉末，mp >300℃;可溶于甲醇、乙醇。IRνKBrmax (cm-1)：3 450(-OH), 2 931，1 690(>C=O)，1 647, (>C=C<)，1 455，1 384，1 252，1 157，1 044，769。UVλMeOHmax nm：205。FABMS m/z：525(M+Na)+，483(M-H-H2O)，438(M-HCOOH-H2O)。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ：1.13(3H,s，Me)，1.16(3H,s.Me)，1.46(3H,s.Me)，1.71 (3H,s.Me)，1.76(3H,s.Me)，1.11(3H,d，J=6.4,Me),3.06(1H,s,H-18),3.35(1H, dd,J=11.6,4.3,H-3)，5.11(1H,br,s,19-OH,重水交换消失)，5.62(br,t,H-12)。13C-NMR (100MHz, C5D5N)见表1。以上数据及理化性质与文献[3]中ilexgenin A一致，故鉴定为ilexgenin A。
       3.7 化合物7无色细小针晶，mp243～244℃;可溶于甲醇、乙醇。IRν KBrmax (cm-1)：3 436(-OH), 2 928，1 697(>C=O)，1 637, (>C=C<)，1 456，1 370，1 167，1 071，1 041，762。 FABMS m/z：789(M+Na)+， 455，437。1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ：0.88(3H,s，Me)，1.08(3H,s.Me)，1.09(3H,s.Me)，1.12(3H，d，J=7,Me)，1.25(3H,s,Me)，1.42(3H,s，Me),1.74(3H,s. Me),3.28(s,H-18),4.81(1H,d,J=7,Xyl-H-1)，5.05(s,19α-OH，重水交换消失)，5.35(1H,d,J=7.5,Glu-H-1)，5.54(1H,t, H-12)。 13C-NMR (100MHz,C5D5N)见表1。 以上数据及理化性质与文献[3]中ilexsaponin B1一致，故鉴定为毛冬青皂苷B1(ilexsaponin B1)。
       3.8 化合物8白色无定形粉末，可溶于甲醇、乙醇。IRν KBrmax(cm-1)：3 436(-OH), 2 927，1 697(>C=O)，1 637, (>C=C<)，1 456，1 387，1 075，1 041，985，813，763。 FABMS m/z：935(M+Na)+;1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ：0.83(3H,s，Me)，1.06(3H,s.Me)，1.32(3H,s.Me)，1.41(3H,s，Me)，1.74(3H，s，Me)，1.11(3H,d,J=7.2,Me)，1.77(3H,d,J=6.4，rha-Me),3.3(1H,s,H-18),4.89(1H,d, J=5.4, Xyl-H-1)，5.04(1H,s,19α-OH，), 5.53 (1H,br，t, H-12)，5.80(1H,d,J=7.6,Glu-H-1),6.40(1H, br，s, rha-1-H)。13C-NMR (100MHz, C5D5N,)见表1。 以上数据及理化性质与文献[3]中ilexsaponin B2一致，故鉴定为毛冬青皂苷B2(ilexsaponin B2)。
       3.9 化合物9白色无定形粉末，mp290～291℃;可溶于甲醇、乙醇。Liebermann- burcharde试验和α-萘酚试验均呈阳性，IRνKBrmax (cm-1)：3 400(-OH), 2 925，1 720(>C=O)，1 630,(>C=C<)，1 443，1 380，1 060，1 020，985，790，755。FABMS m/z：687(M+Na) +。酸水解检查出葡萄糖，苷元部分TLC与化合物6薄层色谱行为一致，根据以上数据及理化性质并与文献[3]比较，鉴定为毛冬青皂苷甲(ilexsaponin A1)。
       3.10 化合物10白色细针状结晶，mp281～283℃;可溶于甲醇、乙醇、氯仿等。Liebermann- burcharde试验呈阳性，IRνKBrmax(cm-1)：3443(-OH), 2 933，1 692(>C=O)，1 649, (>C=C<),1452，1372 1278， 1 035，999。UVλ MeOHmax nm 234(ε7431)。EIMS m/z：454(M+)，436(M-H2O)，408(M-HCOOH)，390(95)(M -HCOOH，-H2O)，375，347，246，231，207，201，189，187，185(100)，145，119，55。1H-NMR(600MHz， CDCl3)δ：0.79(3H,s，Me)，0.90(3H,s.Me)，0.97(3H,s.Me)，0.99(6H,s，2×Me)，1.04(3H，d，J=6.6,Me-CH)，1.73(3H,s, Me-C=)，3.23(1H,dd,J=10.8,4.8,C3-H),5.41(1H,宽s,C12-H)。以上数据与文献 [4]中毛冬青苷甲的苷元数据基本一致，又根据DEPT碳谱数据，以乌索酸及其甲酯为基本母核对其碳信号进行归属，13C-NMR(600MHz，CDCl3)数据见表1。根据以上数据，鉴定(10)为毛冬青酸(ilexolic acid)，即(18-去氢-20-表-乌索酸)。经查文献，本品为首次从天然产物中获得，为了检测其在天然产物中的存在，取毛冬青根，加水煎煮，浓缩，乙醇沉淀，滤过，滤液挥去溶剂，残留物加少量水稀释，用醋酸乙酯萃取，回收溶剂后，残留物以甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，另取结晶10用甲醇制成每1 ml含约0.1 mg的溶液，作为对照品溶液，以乙腈∶甲醇∶水∶乙酸铵(70∶16∶14∶0.5)为流动相，以高效液相色谱法检测，检测波长234 nm，结果在供试品色谱中在与对照品相同的保留时间处检测到色谱峰。
       3.11 化合物11无色针晶，mp 139～141 ℃;ESI/Ms测得M+Na峰437和M-H峰413，与已知品β-谷甾醇共薄层色谱，Rf值和色斑一致，IR与The acdrich library infrared spectra中β-谷甾醇一致，故鉴定为β-谷甾醇。表1 化合物 6～8、10的13C-NMR数据
       【参考文献】
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