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       【摘要】 
       目的研究中药五鹤续断叶18S rRNA基因的序列特征，为五鹤续断分子鉴定提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定五鹤续断的18S rRNA基因核苷酸序列，并分析其序列组成。结果通过对五鹤续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai 叶的18S rRNA基因序列进行测序，获得了五鹤续断18S rRNA基因序列特征。结论DNA测序技术可作为五鹤续断基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法，也可为五鹤续断分子鉴定提供基础性资料。
       【关键词】  分子鉴定; 五鹤续断; 18S rRNA基因; 序列分析
       五鹤续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai为产于湖北省恩施自治州鹤峰县和宜昌市五峰县中药，属川续断科植物，多年生草本，药用部位为其干燥根[1]，常生长在海拔1 200～2 500 m的高寒地区，具有耐严寒、喜湿润等特征，无病虫害等特点，是上等的中药原料。五鹤续断经过加工后具有根条粗，无头尾，质柔软，墨绿色(俗称乌梅色)菊花心，气味微苦，微甜而涩的品质特色。尤其是“乌梅花心”的特征享誉国内外[2]，为恩施州道地药材。其有效成分主要有皂苷、挥发油类、生物碱类和维生素E等，它具有补肝益肾，续接筋骨，止血安胎等功效，临床上主要用于治疗跌打损伤、骨折[3]、腰椎骨质增生、先兆性和习惯性流产[4]等症。
       传统上五鹤续断鉴定方法主要是通过其形态和活性成分来进行鉴定，在分子水平上仅见张文蘅等[5]对川续断目(广义)下双参属的两个种在内的21种植物和外类群用叶绿体DNA trnL-F序列进行分析，探讨双参属的系统位置，在国内外尚未见用18S rRNA基因测序方法对五鹤续断基源进行分类鉴定的研究报道。同时，从分子生物学水平研究中药植物基源的基因，寻找有效成分的功能基因，对中药现代化研究也具有重要意义。目前，已广泛运用18S rRNA基因测序技术进行人参、三七、山药、姜黄、大黄等药材的基源鉴定[6～11]。本研究是通过PCR直接测序的方法对产于湖北省鹤峰县的五鹤续断核基因组18S rRNA基因序列特点进行分析，为探讨五鹤续断的系统发育关系和分子鉴定提供分子依据和基础性资料。
       1 材料与仪器
       1.1 材料五鹤续断叶片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，经湖北民族学院医学院中药教研室袁成玉副教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于-80℃冰箱备用。
       1.2 试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs等，购自大连宝生物有限公司;十六烷基三甲基溴化锭(CTAB)为Geneview分装，购自北京鼎国生物技术有限责任公司;引物由大连宝生物有限公司合成。
       1.3 仪器梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司：电泳仪购自北京六一仪器厂;BeckmanD/U530紫外分光光度计购自美国Beckman公司。
       2 方法
       2.1 DNA的提取采用改良的CTAB法抽提五鹤续断基因组DNA，样品吸光值D(260)/D(280)在1.8～2.0之间，经纯化后将DNA浓度调整为50 μg/L应用。
       2.2 PCR扩增18S rRNA基因PCR扩增的通用引物根据Sogin设计的序列合成，分别为18SF(5′-CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3′)和18SR(5′-CTG ATC CTT CTG CAG GTT CAC CTA C-3′)[12]。PCR反应体系为50 μl，其中50～100 ng模板DNA，10×PCR Buffer(含Mg2+)5 μl，2.5 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L引物，Taq DNApol 1.5U，灭菌双蒸水补足体积为50 μl。优化条件，其18S rRNA最佳的扩增程序为98℃10 s，1个循环，65℃8 min，30个循环;72℃ 8 min，1个循环。
       将PCR产物取8 μl用1%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下照射观察，其余的PCR产物送上海英骏生物技术公司(Invitrogen)测序。
       2.3 序列分析PCR产物序列由上海英骏生物技术公司测序。得到基因序列后，在GeneBank上进行Blast，证实属于续断属植物18S rRNA基因序列，并已提交GeneBank，注册登记号为GQ906563。
       3 结果
       在本研究中，为避免五鹤续断含有的多糖对实验结果的影响，采用改良的CTAB法提取得到样品的总基因组DNA，吸光值D(260)/D(280)在1.8～2.0之间，电泳图(见图1)可明显看出DNA条带清晰整齐，无明显的拖尾现象，表明该DNA样品质量较好，符合实验要求。利用18S rRNA基因通用引物进行PCR扩增反应，获得预期约1.8kb的双链产物(见图2)。经过测序结果发现，五鹤续断18S rRNA基因核苷酸序列长度为1753bp，其G+C含量为49.97%。根据Genebank上blast比对与亲缘关系最近的川续断科Dipsacus sp. Jansen 931(注册登记号为U43150)的同源性为99%，仅三个位点变异，第6个位点缺失，第1075(G-K)和1290(G-N)位点发生置换。1-D. asperoides 1-D. asperoidesDNA M-λ-Hind III M-200bp DNA Ladder plus　图1 样品DNA电泳图 图2 18S rRNA基因的PCR产物电泳图
       4 讨论
       五鹤续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai的干燥根，是常用中药。其产地以湖北省五峰县、鹤峰县为主，量大质优，故名“五鹤续断”。《湖北中药资源》载湖北续断为川续断科川续断，多为野生，少家种，主要分布的最佳适生地带为鄂西南山区的鹤峰、巴东、建始、利川、恩施、五峰、长阳等县市[13]。冯耀兰等编著的《中药材商品规格质量鉴别》一书，从续断历代的商品质量角度，较为详细的介绍了主产五峰、鹤峰两地续断的地道性及其优良的品质特征，书中载：川续断主产湖北巴东、长阳、宜昌、鹤峰、兴山、五峰、四川涪陵、湖南石门、桑植，以湖北产量大，质量优，尤以鹤峰质量最优[14]。在五鹤续断的原产地鹤峰，2001年被湖北省科技厅、省药监局确定为“湖北省续断药材规范化种植研究及示范建设基地”。这些都佐证五鹤续断为恩施州道地药材。为保证其道地性，有必要找到其特有的分子标记并制定其分子鉴定标准。而18S rRNA基因序列结构功能十分保守，进化速度较慢，若其序列存在变异就能成为一种很好的DNA标记，可用于鉴别中药品种[15]。
       本实验所得五鹤续断18S rRNA基因序列与亲缘关系较近的Dipsacus sp. Jansen 931比对，发现有三个位点变异，即在第6个位点缺失，第1075(G-K)和1290(G-N)位点发生置换，其余的完全相同，同源性为99%。说明18S rRNA基因的序列长度保守，该基因在续断科内的差异很小，反映了种内的遗传稳定性，说明五鹤续断的18S rRNA基因序列保持了高度的同源性，但又有少量稳定的种内差异性，是十分保守的序列，可以此确定作为该物种的基源。
       为获得准确可靠的实验结果，我们分3次对同一株五鹤续断叶片的总DNA进行提取，每次提取3支，每支提取的DNA都做2次PCR扩增，并在DNA提取和PCR扩增过程中都做了阴性对照实验，最终每个基因选取3个良好的扩增产物用于测序，所获得结果相同，证明了本实验结果的准确性和可靠性。
       我们首次成功克隆测序出五鹤续断18S rRNA基因，并对其基因序列结构进行了初步分析。这一研究为从分子水平上探究五鹤续断这一物种系统进化关系以及物种分析鉴定等提供了一些基础性资料。
       研究表明，18S rRNA基因可作为五鹤续断的理想分子标记，通过测序、同源性比较，能了解其基因结构组成特点，而且DNA测序稳定性强，重复性好，结果准确可靠，可作为五鹤续断鉴定的依据，也为下一步了解五鹤续断的分子系统发育关系提供基础性资料，还可克服某些情况下形态学鉴定和理化鉴定的误差，进行准确的分子鉴定。
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