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       【关键词】  萃取;,,绿原酸;,,纯化
       摘要：对金银花粗提粉中萃取高纯度绿原酸的方法进行了研究。萃取分配系数 D测定结果表明，醋酸乙酯是纯化绿原酸的适用溶剂。四级萃取的绿原酸回收率将近90%，得到的产品经 UV和 HPLC检测绿原酸含量分别为69.1%和35.2%。从 LC-MS检测结果推断，产品中含有绿原酸异构体和异绿原酸。
       关键词：萃取;  绿原酸;  纯化
       Study of Extracting Process of Chlorogenic Acid by Ethyl Acetate
       YANG Haiyan, SUN Feng, WANG Aiguo, CHEN Fuming, GUO Zhigang
       (Institute of Tsinghua University in Shenzhen Center For Advanced Material ＆ Biomedicine, Shenzhen 518057,China; Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)
       Abstract：The extraction method of chlorogenic acid(CGA) from the crude honeysuckle powder is studied. The distribution coefficient D indicated: Ethyl acetate was the most suitable extractant for CGA"s purification. After 4-stage extractions, test date showed that CGA"s content of the product were 35.2% and 69.1% by HPLC and UV respectively. The experimental CGA recovery ratio was almost 90%. The product was determined containing CGA"s isomer and isochlorogenic acid by LCMS test.
       Key words:Extraction;   Chlorogenic acid;  Purification
   
　　绿原酸（chlorogenic acid）是由咖啡酸（caffeic acid）与奎尼酸（鸡纳酸，quinic acid，即1羟基六氢没食子酸）组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名3O咖啡酰奎尼酸（3Ocaffeoylquinic acid），分子量：354.30，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，为众多药材（如金银花、茵陈、杜仲）以及中成药（如复肝宁、双花注射液）抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，同时是某些中药制剂质量控制的重要指标［1］。随着中药现代化进程的加快，制药厂家对金银花等的提取物要求越来越高，特别是欧、美国家制药企业要求中药提取物中的单体成份越纯越好，以便定性定量分析、使用。目前，我国以金银花为原料加工制成的市售产品除复方制剂外，多为浸膏或粗粉［2］，其中绿原酸含量较低，高含量的绿原酸产品上市量很少，且价格昂贵，远远不能满足市场需求。研究新的高含量绿原酸提取分离方法，降低提取分离成本是当务之急。目前从金银花中提取高纯度绿原酸的研究方法主要有溶剂萃取法和大孔树脂吸附法。前者容易实现工业化生产，可选择的溶剂包括醋酸乙酯、正丁醇、异戊醇，后者在进行规模化生产时存在生产周期长的缺点，故而本文以市售金银花粗粉为原料，选择沸点低、价格低的醋酸乙酯为溶剂对绿原酸进行萃取纯化，探讨萃取过程的影响因素，为下一步工业化生产高纯度绿原酸奠定基础。
       　　1  材料与方法
       1.1   材料与仪器采用水提制备的金银花粗提粉，购于安徽宣城百草植物工贸有限公司。绿原酸对照品购自美国Sigma公司。醋酸乙酯等均为分析纯。美国 Agilent公司1100型高效液相色谱。美国 Agilent公司8453型分光光度计。Agilent 1100型高效液相色谱-ESQUIRE 2000型离子阱质谱检测仪。质谱扫描条件：离子化源为电喷雾离子化源 ESI，检测方式为二级质谱，全范围为50～2 200 m/z，加热毛细管温度为300℃。
       1.2   工艺流程金银花粗提粉 →水溶 →醇沉 →蒸去乙醇 →醋酸乙酯萃取 →减压浓缩 →冷冻干燥金银花粗提粉水溶液的醇沉过程本文作者已进行了详细研究，确定最佳醇沉度为60%，醇沉可有效去除金银花粗粉中的杂质,有关研究另文陈述。醇沉后离心过滤，回收乙醇，剩余液用盐酸调节 pH后进行萃取。
       1.3   绿原酸含量测定
       1.3.1   UV法准确称取绿原酸标品10 mg，用50%甲醇定容至100 ml，分别用50%甲醇稀释10，5，3.33，2.5，2，1.67倍，以50%甲醇为空白，用1 cm比色杯于327 nm波长处测吸收度。以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制绿原酸标准工作曲线，得到回归方程：Y= 18.302X，r=0.999 5 。绿原酸含量在10.0～60.0 μg/ml，范围内，浓度与吸光度间呈良好的线性关系。
       1.3.2   HPLC法含量测定色谱条件：参照2005年版《中国药典》附录中绿原酸的高效液相色谱法［3］。色谱柱：ZORBAX C18 ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；检测波长为327 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。 线性回归方程：Y= 48.64X-52.57，r=0.999 1 。绿原酸在26.0～173.3 μg/ml与峰面积呈良好的线性关系。
       1.4   总糖含量测定采用蒽酮硫酸法［4］。线性回归方程：Y= 196.96 X，r=0.998 9 。总糖在5.0～100.0 μg/ml范围内，浓度与吸光度间呈良好的线性关系。
       　　2  结果与分析
       2.1  原料含量分析将金银花粗提粉制成供试液，其中总糖含量为43.33%，总绿原酸含量为12.0%，绿原酸含量为5.5%（HPLC测定）。
       2.2   金银花粗提粉在醋酸乙酯水体系中的 D值测定预先配制醋酸乙酯与去离子水体积比为1∶1混溶分相后的上、下相。随后称取10 g粗粉，溶于100 ml配制好的下相中，用浓盐酸调节 pH=2.0，量取50 ml该溶液，加入到100 ml分液漏斗中，加入等体积预先混溶过的醋酸乙酯，充分振摇20 min，达到平衡后，分出上、下相，分别取1 ml用甲醇稀释测定浓度。测得在醋酸乙酯-水体系中的萃取分配系数 D=0.69。参考绿原酸在其它溶剂体系［5］的 D值（见表1）可以看出，绿原酸在醋酸乙酯里的分配比较大，醋酸乙酯较正丁醇而言，沸点低，便于回收溶剂，且价格低廉。
       表1   绿原酸在不同溶剂体系的 D值（略）
       2.3  pH对萃取结果的影响分别称10 g金银花粗提粉配成50 ml水溶液，用一定浓度的盐酸溶液分别调 pH值为1.0，2.0，7.0，用醋酸乙酯按相比1分别称10 g金银花粗提粉配成50 ml水溶液，用一定浓度的盐酸溶液分别调 pH值为1.0，2.0，7.0，用醋酸乙酯按相比1∶1四级错流萃取，各自合并上相。用紫外测定产品中的总绿原酸和总糖量。结果见表2。1四级错流萃取，各自合并上相。用紫外测定产品中的总绿原酸和总糖量。结果见表2。
       表2  不同 pH条件下萃取测定结果（略）
 
　　结果表明，pH小于2的酸性条件下绿原酸的萃取收率高，表明绿原酸以分子酸的形式更容易被萃取到有机相，但相应的产品中测到总糖含量也较高，分析认为，除了由于粗提物中的部分多糖被混溶到有机相的水带进产品以外，粗提物中的黄酮苷也被萃取到了有机相所致。
       2.4  萃取时间对绿原酸收率的影响采用电磁搅拌装置考察醋酸乙酯对绿原酸的萃取速率。结果见图1。图1表明，醋酸乙酯萃取绿原酸的过程为一快速过程，3 min即已达到平衡，延长萃取时间对绿原酸收率影响不大，因此其余实验的萃取时间均选择5 min。
       图1   萃取时间对绿原酸收率的影响（略）
       2.5   多级萃取实验醋酸乙酯在原料液pH=1.5的条件下萃取绿原酸的分配比为0.69，在该萃取条件下，根据萃取公式计算，当有机相和水相体积比等于1时，进行N级萃取后，绿原酸的萃取回收率ρ=1－1/（1+K）N，通过计算，当进行4级萃取后绿原酸的萃取率可达87.74%。为此进行4级萃取实验：将50 g粗提粉用100 ml水溶解后，调节 pH=2.5，加入醋酸乙酯经过4级萃取，萃取液和萃余液分别进行浓缩、冷冻干燥得到产品。精密称取样品进行分析检测。结果见表3。
       表3  四级错流萃取测定结果（略）
       HPLC分析结果得出，产品中绿原酸含量35.2%，收率为90.52%，实验值和理论预测值吻合较好。根据绿原酸 UV法分析结果，产品中绿原酸含量为69.1%，收率为81.44%，这个结果比 HPLC法测定值偏高，表明产品中除绿原酸外还含有绿原酸的异构体、异绿原酸、咖啡酸等在327 nm处也有紫外吸收的物质。
       2.6   萃取产物成分鉴定将萃取产品进行 LC-MS检测，液相流动相条件为：甲醇-0.5%乙酸溶液（40∶60）；检测波长为327 nm；柱温：25℃。图1所示为液相的紫外图谱，产品中有7个含量较高的化合物，分别对应于7个峰，峰1，2，3，4，5，6，7。其保留时间（tR）分别为2.260，2.684，3.176，3.709，4.831，5.483，8.879 min，峰1至7分别所对应的化合物准分子离子峰m/z依次等于377，377，377，391，539，539，539，均为［M+Na］+峰，计算出对应化合物的分子量分别为354，354，354，368，516，516，516。因此推断其中的峰1，2，3应归属为绿原酸及其同分异构体（理论分子量354.30），峰5、6、7归属为异绿原酸（理论分子量516.44）。峰1，2，3的二级质谱图中，出现了离子峰 m/z等于214.9的碎片离子峰(参看图3)，表明是绿原酸分子离子脱去咖啡酸后的奎尼酸。峰6和7的二级质谱图中，出现了离子峰m/z等于377的碎片离子峰（参看图4），表明是异绿原酸分子离子脱去一分子咖啡酸所得。推测峰4为绿原酸甲酯。
       图2  萃取产物的 HPLC-MS谱图分析结果示意图（略）
       图3  组分2质谱图（略）
       图4  组分6，7的质谱图（略）
       3  结论
       对金银花粗粉在醋酸乙酯-水体系中的萃取分配系数测定得 D=0.69，表明醋酸乙酯是萃取绿原酸的适用溶剂，pH小于2的酸性条件下绿原酸的萃取收率高。实验结果表明，经过4级错流萃取，粗粉中将近90%的绿原酸被萃取到上相，所得萃取产品中绿原酸的含量经 UV检测为69.1%，经 HPLC检测为35.2%。对醋酸乙酯萃取产物做 LC-MS检测，结果推断产品中含有绿原酸和异绿原酸。
       　参考文献：
       ［1］  尉  芹，马希汉. 绿原酸及其提取分离方法评述［J］.中成药，2001,23(2):135.
       ［2］  刘军海，裘爱泳. 绿原酸及其提取纯化和应用前景［J］.粮食与油脂，2003，（9）：44.
       ［3］  国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：152.
       ［4］  林颖，吴毓敏，吴  雯，等. 天然产物中的糖含量测定方法正确性的研究［J］.天然产物研究与开发，1996,8(3):5.
       ［5］  曹学丽. 高速逆流色谱分离技术及应用［M］. 北京：化学工业出版社，2005：234.
       (深圳清华大学研究院新材料与生物医药研究所，广东 深圳  518057；清华大学化学工程系，北京  100084)