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       【关键词】  妇舒片；,,大黄素；,,大黄酚；,,薄层色谱法；,,高效液相色谱法
       摘要：目的建立妇舒片的质量标准。方法采用薄层色谱法鉴别妇舒片中的大黄、牡丹皮、乌药；并采用高效液相色谱（HPLC）法测定该药中大黄素、大黄酚的含量。结果在薄层色谱中可检测出大黄、牡丹皮、乌药，大黄素在52.2~261.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 5，平均加样回收率为98.77%，RSD=1.02%(n=6)；大黄酚在108.1~540.5 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 6，平均加样回收率为99.27%，RSD=1.92%(n=6)。结论所建立的方法简便易行，重现性好，可有效地控制该制剂的质量。
       关键词：妇舒片；  大黄素；  大黄酚；  薄层色谱法；  高效液相色谱法
       Study on Quality Standard for Fushu Tablet
       LI Jia，HUANG Jianyou，DENG Zhixu，LONG Jiechao，ZHEN Hanshen
       （Guangxi Institute of TCM,Nanning 530022,China;Guangxi College of TCM,Nanning 530001,China）
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Fushu Tablet.MethodsRadix et Rhizoma Rhei,Cortex Moutan,Radix Linderae in Fushu Tablet were identified by TLC.The content of emodin and chrysophanol in Fushu Tablet was determined by HPLC.ResultsRadix et Rhizoma Rhei,Cortex Moutan,Radix Linderae could be detected by TLC.Emodin showed a good linear relationship at range of 52.2~261.0 μg,r=0.999 5, the average recovery rate was 98.77%,RSD=1.02%(n=6).Chrysophanol showed a good linear relationship at a range of 108.1~540.5 μg,r=0.999 6, the average recovery was 99.27%,RSD=1.92%(n=6).ConclusionThe established method is simple,feasible and reproducible. This study provides a method for the quality control of Fushu Tablet.
       Key words：Fushu Tablet;  Emodin;  Chrysophanol;  TLC；  HPLC
   
　　妇舒片是新研制的中药新药，由大黄、牡丹皮、乌药等中药组成，具有清热解毒，行气化淤，除湿止带之功效，用于治疗妇女湿热所致的带下、痛经。为了有效控制该药品质量，本文采用薄层色谱法对方中大黄、牡丹皮、乌药进行定性鉴别，并采用HPLC测定方中大黄的有效成分大黄素和大黄酚。
       　　1  仪器与试药
       日本岛津LC10A高效液相色谱仪，UV10A紫外检测器；威玛龙色谱工作站；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯；大黄素、大黄酚、芍药苷对照品、乌药对照药材由中国药品生物制品检定所提供；妇舒片及各被检药材的阴性制剂均为自制。
       　　2  方法与结果
       2.1  薄层鉴别
       2.1.1  大黄的鉴别取本品10片，除去包衣，研细，加甲醇20 ml浸泡1 h，滤过，取滤液5 ml，蒸干，加水10 ml使溶解，再加盐酸1 ml，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚分2次振摇提取，20 ml/次，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺大黄的阴性制剂10片，同法制成阴性对照溶液。另取大黄对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取大黄素、大黄酚对照品，加氯仿制成每毫升中各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述四种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚（30~60℃）甲酸乙酯甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色，而阴性无干扰。结果见图1。
       2.1.2  牡丹皮的鉴别取本品12片，除去包衣，研细，置索氏提取器中，加石油醚（30~60℃）40 ml，加热回流1 h，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，加甲醇50 ml，加热回流3 h，滤过，滤液回收甲醇至干，残渣加水20 ml使溶解，移置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次（20，10，10 ml），合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，20 ml/次，正丁醇蒸干，残渣用适量水溶解后，通过聚酰胺柱（1.2 cm×10 cm，5 g），用水50 ml洗脱，洗脱液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺牡丹皮的阴性制剂12片，同法制成阴性对照溶液。另取牡丹皮对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取芍药苷对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述四种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿甲醇（8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性无干扰。结果见图2。
       2.1.3  乌药的鉴别取(鉴别)(1)项下乙醚液，蒸干，残渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺乌药的阴性制剂10片，同法制成阴性对照溶液。另取乌药对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚 （30~60℃）甲酸乙酯甲酸（15∶6.5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性无干扰。结果见图3。
       2.2  含量测定
       2.2.1  色谱条件与系统适应性实验色谱柱：Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇0.1%磷酸溶液（90∶10）；流速：1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长：254 nm，进样量10 μl。
       2.2.2  对照品溶液的制备分别精密称取大黄素及大黄酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含大黄素15 μg，大黄酚32 μg的混合溶液。
       1.大黄素、大黄酚对照品2.大黄对照药材3.妇舒片样品4.阴性对照   
       图1  大黄的薄层色谱图（略）         
       1.芍药苷对照品2.牡丹皮对照药材3.妇舒片样品4.阴性对照
       图2  牡丹皮的薄层色谱图（略）       
       1.乌药对照药材2.妇舒片样品3.阴性对照
       图3  乌药的薄层色谱图（略）
                     
　　2.3  供试品溶液的制备取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇约20 ml，超声处理1 h，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置50 ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，残渣加稀盐酸10 ml，超声处理5 min，再加氯仿20 ml，加热回流1 h，立即冷却，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取3次，每次约10 ml，合并氯仿液并移至100 ml锥形瓶中，挥去氯仿，残渣精密加入甲醇10 ml，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取滤液，作为供试品溶液。
       2.4  阴性对照溶液的制备按处方比例称取除大黄以外的其他药材，按处方制法制备缺大黄的阴性样品。按2.3项下方法制成阴性对照溶液。
       2.5  测定方法分别精密吸取上述3种溶液各10 μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，结果表明供试品有与大黄素、大黄酚对照品相同保留时间的色谱峰，与其他组分离良好，大黄素峰和大黄酚峰保留时间分别为11.52 min和16.74 min，阴性对照溶液在大黄素、大黄酚出峰时间没有任何杂质峰。色谱图见图4。
       2.6  方法学考察
       2.6.1  线性关系考察精密称取大黄素对照品5.22 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，精密量取1，2，3，4，5 ml，分别置10 ml量瓶中；精密称取大黄酚对照品10.81 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，精密量取1，2，3，4，5 ml，分别加入装有同等体积的大黄素的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为大黄素、大黄酚混合对照液。精密吸取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定其峰面积值，以溶液浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归。得大黄素回归方程为：Y=24 578X-17 462，r=0.999 5。结果表明：大黄素在52.2~261.0 μg，其峰面积与浓度之间线性关系良好。大黄酚的回归方程为：Y=39 532X-29 796，r=0.999 6。结果表明：大黄酚在108.1~540.5 μg，其峰面积与浓度之间线性关系良好。
       2.6.2  精密度实验精密吸取大黄素（15.20 μg/ml）及大黄酚（32.33 μg/ml）对照品溶液各10 μl，分别连续重复进样6次，测定大黄素、大黄酚的峰面积，其峰面积值RSD大黄素为1.56%，大黄酚为1.29%。
       2.6.3  稳定性实验精密吸取同一批号的供试品溶液（批号：050103），在上述色谱条件下，于0，2，4，6，12，24 h测定峰面积，大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.26%，1.60%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
       a大黄素            b大黄酚
       图4  大黄素及大黄酚对照品（A）、妇舒片（B）、阴性对照液（C）HPLC色谱图（略）
       2.6.4  重复性实验取同一批号的样品6份约0.5 g（批号：050103），按2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。结果，大黄素、大黄酚的平均含量分别为0.702 mg/片和1.493 mg/片，RSD分别为1.16%和2.27%。
       2.6.5  回收率实验取已知含量的供试品（大黄素含量：0.702 mg/片，大黄酚含量：1.493 mg/片，平均片重：0.501 8 g/片）研细，精密称取6份，每份约0.25 g，置25 ml容量瓶中，精密加入大黄素、大黄酚混合对照品溶液（精密称取大黄素对照品4.41 mg，大黄酚对照品9.40 mg，置同一50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度）4 ml，按2.3项下方法操作，分别注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定大黄素、大黄酚的峰面积，结果大黄素的平均回收率为98.77%，RSD为1.02%(n=6)；大黄酚的平均回收率为99.27%RSD为1.92%。结果见表1~2。
       表1  大黄素回收率（略）
       表2  大黄酚回收率（略）
       2.6.6  供试品含量测定取本品5批，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定。结果见表3。
       　　3  讨论
       3.1  对含量测定中样品的前处理方法进行了研究，比较了不同的提取溶剂（甲醇、乙醇），不同的提取方法（回流提取、超声提取、索氏提取），不同的提取时间（50，60，70 min），结果选定以甲醇溶剂作为提取溶剂，超声提取70 min，既保证被测成分提取完全，又省时简便。
       表3  妇舒片中大黄素与大黄酚的含量测定结果（略）
       3.2  流动相组成及配比选择 参考文献［1~5］，曾试用不同配比的甲醇水，甲醇0.1%磷酸溶液，摸索液相色谱的最佳测定条件，试用结果表明，选用甲醇0.1%磷酸溶液（90∶10）为流动相，大黄素峰和大黄酚峰的出峰时间较适宜（分别为11.52 min和16.74 min），与其它共存成分分离度大于1.5，达到基线分离。
       3.3  检测波长的选择 取大黄素对照品和大黄酚对照品溶液，在200~700 nm波长范围内进行扫描，结果大黄素、大黄酚在251~255 nm范围内均具有较强的吸收，又据文献［1，6~7］，多采用254 nm为同时测定大黄素、大黄酚的检测波长，故选择254 nm为本实验的检测波长，实验表明该波长检测灵敏度高，杂质吸收峰少，干扰小，效果理想。
       3.4  大黄中所含大黄素和大黄酚等羟基蒽醌多为与葡萄糖等结合型衍生物，约有10%~25%为游离状态［8］，为了有效、完全地提取大黄素、大黄酚，必须加入一定量的盐酸水解并进行超声提取，以促使结合型蒽醌糖苷全部水解成游离型蒽醌，以便测定大黄素和大黄酚的总量。
       3.5  本实验建立了HPLC法测定妇舒片中大黄素、大黄酚含量的方法。实验结果表明本法操作简便、准确、重现性好，可作为该制剂的质量控制方法。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：18.
       ［2］  周燕雪.HPLC法测定金砂五淋丸中大黄素、大黄酚的含量［J］.青海医学院学报，2004，25（2）：110.
       ［3］  霍艳玲，刘丽文，张曦弘.HPLC法同时测定利胆排石颗粒中大黄素及大黄酚的含量［J］.辽宁中医杂志，2004，31（3）：251.
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       (广西中医药研究所，广西 南宁  530022；广西中医学院，广西 南宁  530001)